微生物絮凝劑產(chǎn)生菌絮凝活性研究

摘 要：從福州郊區旱田地表土壤中分離得到一株絮凝劑產(chǎn)生菌，根據菌落形態(tài)特征，初步鑒定為鏈球菌。研究表明，培養基組成如下：碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏，培養基初始 pH 值為 5 ~ 8.5之間能取得較好的效果，添加一定濃度的 Na+、Mg2 、Ca2 對培養液的絮凝活性有促進(jìn)作用，而培養液中少量的 Cu2 、Fe3 、Zn2 可抑制絮凝活性，該絮凝劑對高嶺土懸浮液有較好的絮凝效果。結合實(shí)驗現象和雙電層理論初步推測了該絮凝劑的絮凝過(guò)程模型，對進(jìn)一步研究微生物絮凝劑的絮凝機理有一定的參考作用。

關(guān)鍵詞：微生物  絮凝劑 絮凝活性

微生物絮凝劑是微生物在其代謝過(guò)程中分泌的能使液體中不易沉降的固體顆粒凝集，繼而沉降的高分子物質(zhì)。微生物絮凝劑不僅具有傳統絮凝劑的特性，因其成分為糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、核酸等，具有可生物降解、無(wú)二次污染等獨特性質(zhì)，已被應用于高濃度有機廢水、粉煤灰、高嶺土、泥漿水與印染廢水等的處理工藝中，被認為是繼無(wú)機絮凝劑、有機絮凝劑之后的一種新型的絮凝劑。

微生物絮凝劑研究目前主要集中在微生物的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化、分離純化、分子結構的解析、絮凝作用機理、絮凝條件的應用、通過(guò)現代基因技術(shù)組建工程菌等方面。

本研究報道一株土壤中分離得到的鏈球菌所產(chǎn)微生物絮凝劑的絮凝特性，并從絮凝劑的產(chǎn)生條件和絮凝條件角度探討了微生物絮凝劑在不同培養條件和絮凝條件下對高嶺土懸浮液的絮凝效果，并嘗試根據實(shí)驗現象結合雙電層理論解釋提出該絮凝劑的絮凝過(guò)程簡(jiǎn)單模型，對進(jìn)一步研究微生物絮凝劑的絮凝機理有一定的參考作用。

1 實(shí)驗材料和方法

1.1 微生物的篩選與分離

取福州近郊旱田黑色地表土作為培養來(lái)源。將不同懸浮液在富集培養基中培養至培養液出現渾濁，菌懸浮液劃線(xiàn)涂布于固體培養基表面，觀(guān)察菌落形態(tài)為蛋清狀的菌落挑取后經(jīng)斜面培養多次劃線(xiàn)分離、初步純化，直至稀釋劃線(xiàn)后接連幾次培養皿上長(cháng)出的菌落特征相同，初步認為菌株純化較完全，編號低溫保存。為防止污染，本試驗需在凈化工作臺進(jìn)行，委托福建省防疫站對菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定。

絮凝活性測定：5 g/L的高嶺土溶液調節pH后取50 mL至燒杯中，加入0.5 mL接種微生物的發(fā)酵液樣品，用磁力攪拌器攪拌0.5 min，靜止3 min后吸取上層清液于550 nm處測定吸光值B，空白組為液體培養基代替樣品測定吸光值A。

1.2 微生物最適碳源、氮源的篩選

選用不同碳源、氮源在相同的培養條件下進(jìn)行培養，觀(guān)察絮凝活性的變化，確定適宜的碳源、氮源。

1.3 絮凝劑的培養條件的優(yōu)化

研究培養基初始pH、培養溫度、不同無(wú)機離子種類(lèi)對絮凝活性的影響，確定產(chǎn)絮凝劑的基本培養條件。

1.4 微生物絮凝劑的絮凝特性

研究絮凝對象中金屬離子種類(lèi)和濃度等對絮凝效果的影響。并依據實(shí)驗結果推測絮凝過(guò)程的簡(jiǎn)單模型。

2 結果與討論

從福州旱田土壤中篩選得到一株產(chǎn)絮凝劑微生物，該微生物菌落在培養基平板上有明顯的產(chǎn)莢膜微生物形態(tài)特點(diǎn)，參見(jiàn)表1。

夾膜或粘液層是某些細菌的細胞表面上產(chǎn)生的一層松散的粘液性物質(zhì)。莢膜（capsule）具有一定的外形，相對穩定地吸附于細胞壁外；粘液層（slime layer）則無(wú)明顯的邊緣可擴散到周?chē)�環(huán)境中。細菌莢膜和粘液層的主要成分為多糖、多肽、蛋白質(zhì)，也有少量為DNA，這些化學(xué)成分與已發(fā)現的微生物絮凝劑的成分基本一致。本研究所發(fā)現的微生物絮凝劑經(jīng)分離純化后，主要成分為酸性多糖，詳細研究結果另文報道。

2.1.1 碳源對絮凝活性的影響

以牛肉膏、K2HPO4、少量金屬離子為單因子基礎培養基，根據可溶性淀粉、葡萄糖、蔗糖、甘油、甘露醇、乙醇物質(zhì)中碳元素含量計算應添加碳源質(zhì)量，以不加碳源為對照，碳源實(shí)驗結果見(jiàn)表2。

實(shí)驗表明，不同碳源的選擇變化強烈影響絮凝活性。蔗糖作為碳源時(shí)培養液表現出最佳的絮凝活性，其次為葡萄糖；可溶性淀粉由于本身的溶解度原因反而使濁度上升，其他如甘油等作為碳源時(shí)的絮凝活性小于30%。

2.1.2 培養基中氮源對絮凝活性的影響

以蔗糖，KH2PO4為單因子基礎培養基，根據氯化銨、尿素、牛肉膏、硝酸銨、硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨物質(zhì)中氮元素含量計算應添加的氮源質(zhì)量，不加氮源為對照組。實(shí)驗結果表明：采用了不同的氮源，培養液對高嶺土都有一定的絮凝活性（＞50%）。牛肉膏、氯化銨組絮凝活性最高，尿素最低。實(shí)驗中還發(fā)現，菌體的生長(cháng)與絮凝劑的活性有一定的相關(guān)性。菌體生長(cháng)較好的，絮凝活性也較好；反之則較差。

比較碳源與氮源對絮凝活性的影響發(fā)現：碳源變化對絮凝活性的影響大于氮源。這可能是因為微生物所合成的絮凝劑主要依賴(lài)于微生物從培養基中的糖類(lèi)獲得，當環(huán)境中不存在合成絮凝劑所需要的基本“原料”時(shí)，微生物難以有效合成、分泌絮凝活性物質(zhì)，甚至影響微生物自身的生長(cháng)。Yokoi等研究發(fā)現：Enterbacter sp. 所產(chǎn)生含有蛋白質(zhì)組分的絮凝劑的絮凝活性受到培養基中氮源的影響較碳源大，這一現象可能與培養基中的氮源參與絮凝劑的微生物合成過(guò)程有關(guān)。

2.1.3 培養基中金屬離子對絮凝活性的影響

在一定離子濃度條件下觀(guān)察不同離子對培養液絮凝活性的影響。通過(guò)實(shí)驗發(fā)現：Cu2+、Fe3+、Zn2+離子的存在對絮凝活性有的較強的抑制作用；而Na+、Mg2+、Ca2+對絮凝活性有促進(jìn)作用。在培養基中添加無(wú)機離子后，發(fā)酵培養 1d 后測定培養液絮凝活性，實(shí)驗結果如圖 1。從實(shí)驗結果來(lái)看：培養基中添加 ZnCl2、FeCl3、CuCl2只要達到了 0.1%就將完全抑制絮凝活性的產(chǎn)生。FeCl3的存在使培養基有明顯的顏色，使絮凝活性表現為負值；添加 NaCl、MgCl2、CaCl2 使絮凝活性分別提高�？紤]到培養液中金屬離子對絮凝活性的測定產(chǎn)生干擾，確定培養基基本組成為：碳源 1%、氮源 0.4%、K2HPO40.04%MgSO40.02%、CaCl20.005%。

2.1.4 培養溫度對絮凝活性的影響

為確定絮凝劑產(chǎn)生的適宜培養溫度，其他條件相同的情況下，分別在不同的溫度下發(fā)酵培養 1 天，測定絮凝活性。

從表 4 可以看出微生物在溫度 20℃至 40℃條件下培養，所產(chǎn)生的絮凝活性都＞80%，溫度為 15℃或高于 40℃時(shí)絮凝

活性迅速下降。根據實(shí)驗結果，在本實(shí)驗室條件下培養溫度為 30℃。

2.1.5 培養基起始 pH 值對絮凝活性的影響

在不同的 pH 值條件下，30℃發(fā)酵培養，并測定絮凝活性。結果見(jiàn)圖 2。在培養基起始 pH值為 4 至 9 的范圍內微生物都能分泌絮凝活性物質(zhì)。當 pH 值低于 5.0 或高于 8.5，絮凝活性下降。由于培養基 pH 值約為 5.5，實(shí)驗中調節培養基 pH 值為 7 后進(jìn)行培養。

2.1.6 處理對象中金屬離子對絮凝活性的影響

EDTA溶液將高嶺土充分浸泡，抽濾、洗滌、烘干后配置成 pH = 12 的10g/L 的高嶺土懸浮液。在25mL的高嶺土溶液中分別加入0.5mL、NaCl、CaCl2、FeCl3溶液，再添加蒸餾水稀釋至50mL，使溶液中Na+、Ca2 、Fe3濃度為 2 mmol/L，加入 0.5mL 絮凝劑攪拌后，測定絮凝活性�？瞻诪� EDTA 處理后高嶺土懸浮液。

在絮凝體系中添加 Na+、Ca2 能夠提高絮凝活性，而加入 Fe3 卻使絮凝活性明顯下降。對不同 Ca2 離子的進(jìn)一步研究表明：當體系中 Ca2 濃度為 4 mmol 時(shí)絮凝活性最大，繼續加大 Ca2 濃度，絮凝活性緩慢下降。Kurane對金屬離子對高嶺土懸浮液絮凝影響的實(shí)驗結果表明，加入二價(jià)離子能夠改善絮凝劑對高嶺土懸浮液的絮凝效果，這與本實(shí)驗的結果一致。

2.2 微生物絮凝劑絮凝機理的簡(jiǎn)單模型

一般認為金屬離子的助凝作用來(lái)源于金屬離子對絮凝過(guò)程中凝聚作用和絮凝作用的共同參與。高嶺土懸濁液中投加金屬離子時(shí)，高嶺土顆�？稍陔娦灾泻团c壓縮雙電層作用下，微粒脫穩形成細小的凝聚體。這些細小的凝聚體在絮凝劑的吸附架橋作用下形成大絮體，從而出現沉降。

但綜合本實(shí)驗和其它相關(guān)研究的結果來(lái)看，微生物絮凝過(guò)程中的一些實(shí)驗現象無(wú)法用壓縮雙電層理論圓滿(mǎn)解釋。以下問(wèn)題有待討論：

（1）添加二價(jià)的離子比添加三價(jià)的離子能取得更好的絮凝效果。

（2）過(guò)高的 Ca2 離子濃度會(huì )使絮凝活性降低。

（3）絮凝劑與金屬離子協(xié)同促進(jìn)絮凝的過(guò)程。

Yokoi、Salehizadeh、李桂嬌都對實(shí)驗過(guò)程中發(fā)現的該類(lèi)現象作出了一些解釋。綜合本實(shí)驗結果和其他研究者的研究結論，推測微生物絮凝劑的絮凝過(guò)程的可能步驟如下：

（1）溶液中少量金屬離子，作為一種“反號離子”，一方面受到懸浮顆粒表面電荷的庫侖力作用，聚集、壓縮了高嶺土顆粒表面的雙電層；另一方面受到絮凝劑內部電離基團的作用，被吸附并形成一種可流動(dòng)的反號離子層。

（2）懸浮顆粒與絮凝劑在熱運動(dòng)中接近，懸浮顆粒表面過(guò)剩的負電荷將吸引絮凝劑表面可流動(dòng)的反號離子向該點(diǎn)移動(dòng)，此時(shí)絮凝劑分子就象一條反號離子的“導管”，反號離子從“導管”中流向懸浮顆粒，中和一部分顆粒表面電荷。

在這一過(guò)程中，由于 Fe3 比 Ca2 有較大的正電荷數和較小的離子半徑，導致 Fe3 離子在“導管”中流動(dòng)性下降，無(wú)法有效地降低高嶺土顆粒表面 zeta 電位。對 Pseudomonas sp.所產(chǎn)絮凝劑的絮凝研究中發(fā)現：添加 Fe3 不能有效提高絮凝活性，但電荷數較低的 Fe2 卻能有效提高絮凝活性。

（3）由于電荷中和的作用，降低了膠體顆粒表面的 zeta 電位，同時(shí)使高分子與顆粒間相互連接。按此步驟高分子能與多個(gè)固體顆粒橋連，最后形成大絮體。

 當金屬離子濃度過(guò)高時(shí)，一方面顆粒表面聚集了過(guò)多的金屬離子，導致其表面電荷下降；對于絮凝劑，分子中帶負電荷的基團所帶電荷與金屬陽(yáng)離子發(fā)生電中和，分子內靜電排斥作用降低，在溶液中絮凝劑分子不再具有伸展的結構，甚至金屬離子可能使絮凝劑也帶上了正電荷，出現絮凝活性下降。

這一模型僅初步反映了金屬離子對絮凝劑協(xié)同作用產(chǎn)生絮凝的過(guò)程，沒(méi)有考慮絮凝劑對顆粒的網(wǎng)捕、吸附等作用，也沒(méi)有考慮金屬離子在溶液中的形態(tài)等因素的影響。

3 小結

本實(shí)驗從微生物菌落的形態(tài)入手，快速分離了一株產(chǎn)絮凝劑的微生物；考察并比較了培養基中碳源、氮源對絮凝活性的影響，一定濃度的 Cu2 、Fe3 、Zn2 離子對絮凝活性有抑制作用；Na+、Mg2 、Ca2 對絮凝活性有促進(jìn)作用；為保證較好的絮凝活性，培養基起始 pH值應控制在 5 ~ 8.5 之間；探討高嶺土溶液中添加的金屬陽(yáng)離子種類(lèi)和濃度對絮凝活性的影響，并對該微生物絮凝劑絮凝過(guò)程模型作了簡(jiǎn)要的推測。來(lái)源：谷騰水網(wǎng)

參考文獻：（略）