1 引言
酸雨是全球性三大主要環(huán)境污染之一，不僅能直接傷害農作物，如抑制植物生長(cháng)發(fā)育，降低產(chǎn)量與品質(zhì)，還能間接通過(guò)改變土壤性質(zhì)及影響土壤微生物活性并影響農作物，已成為制約農業(yè)生產(chǎn)的重要因素.面對我國酸雨區面積不斷擴大的嚴峻現實(shí)，減輕酸雨對植物的傷害已成為保障糧食安全的重要論題.有關(guān)稀土農用的研究顯示，稀土可增強植物對冷凍、干旱、重金屬、紫外輻射、酸雨等脅迫因子的耐受能力，這與稀土增強植物光合作用，促進(jìn)營(yíng)養吸收，穩定細胞膜結構，以及提高抗氧化能力等有關(guān).質(zhì)膜H+-ATPase被譽(yù)為植物的主宰酶，參與轉運胞內H+和植物對逆境脅迫的響應.課題組前期研究顯示，酸雨脅迫會(huì )引起水稻葉片中質(zhì)膜H+-ATPase活性變化，在一定范圍能調節胞內pH，維持胞內物質(zhì)穩定，從而增強植物對酸雨脅迫的耐受性.那么稀土增強植物耐酸性是否與質(zhì)膜H+-ATPase活性變化有關(guān)?既然稀土能通過(guò)穩定膜結構來(lái)緩解非生物脅迫的傷害，且質(zhì)膜H+-ATPase活性又與質(zhì)膜環(huán)境密切相關(guān)，那么稀土對酸雨脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性的調節是否也與質(zhì)膜環(huán)境有關(guān)?明晰這些問(wèn)題，不僅對揭示質(zhì)膜H+-ATPase在植物對酸雨適應性機制中的作用至關(guān)重要，也可為形成化控減災的有效途徑提供理論依據.鑒于此，本文選取重要糧食作物水稻作為研究對象，以相對生長(cháng)速率、質(zhì)膜H+-ATPase水解活性與胞內H+熒光強度、CAT活性、H2O2、MDA含量和質(zhì)膜脂肪酸組成為研究?jì)热�，探討鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性的影響機制，以期為豐富稀土增強植物耐酸性機制提供基礎數據，也為尋求化控減災的有效措施提供新的思考方向.
2 材料與方法
2.1 試材培養
供試水稻(Oryza sativa)品種為淮稻8號.挑選籽粒飽滿(mǎn)的種子用0.1%HgCl2消毒10 min，去離子水浸泡后于25 ℃恒溫光照培養箱中催芽2 d，待幼苗長(cháng)至2葉1心時(shí)移入6.88 L周轉箱中水培，營(yíng)養液采用國際水稻研究所(IRRI)常規營(yíng)養液配方，并略作修改.Fe以Fe-EDTA形式加入，保持營(yíng)養液中Fe濃度為2.0 mg · L-1，并加入NaSiO3 · 9H2O保持營(yíng)養液中SiO2濃度為120 mg · L-1，NH+4-N中加入5.89 mg · L-1雙氰胺作為硝化抑制劑.每次用H2SO4或NaOH將營(yíng)養液pH調至5.5，營(yíng)養液每隔3 d更換1次.培養光照強度為300 μmol · m-2 · s-1，光照12 h，晝/夜溫度為30 ℃/24 ℃，相對濕度為60%.待幼苗長(cháng)至3葉1心時(shí)，選長(cháng)勢相近的幼苗進(jìn)行處理.
2.2 試材處理
配制LaCl3溶液(15 mg · L-1).配制pH=1.0的模擬酸雨母液(SO42-/NO3-，3 ∶ 1，V/V)，用母液配制成pH=3.5、2.5的模擬酸雨溶液.用噴霧器先將LaCl3溶液均勻噴施于葉片，滴液為限，待葉面干涸后，將酸雨用同樣的方法噴施于葉片，對照(CK)噴施等量蒸餾水，連續處理5 d.處理結束后，取每株從上到下數第二葉位的葉片進(jìn)行指標測定.實(shí)驗處理設置：CK、pH=3.5 AR、pH=2.5 AR、La(15 mg · L-1)、La+pH 3.5 AR、La+pH 2.5 AR處理組.
2.3 指標測定方法
相對生長(cháng)速率測定參考文獻方法;質(zhì)膜H+-ATPase活性參照文獻方法;用酶解法提取水稻葉片原生質(zhì)體，用BCECF-AM熒光探針染料標記細胞，通過(guò)流式細胞儀測定胞內H+熒光強度來(lái)表示胞內H+濃度;采用高錳酸鉀滴定法測CAT活性和采用硫酸鈦法測H2O2含量;采用硫代巴比妥酸法測MDA含量;采用氣相色譜測定質(zhì)膜脂肪酸組成.
2.4 數據處理與分析
所有數據均為3次獨立試驗的平均值±標準誤差(Mean±SD)，所有原始數據的平均值、標準誤差和差異顯著(zhù)性用 SPSS16.0軟件分析.數據制圖在Origin8.0軟件中完成.
3 結果與分析
3.1 鑭對酸雨脅迫下水稻相對生長(cháng)速率的影響
植物相對生長(cháng)速率常用來(lái)表征植物的抗逆能力，即脅迫下植物生長(cháng)的快慢.由圖 1可知：?jiǎn)我籄R組水稻相對生長(cháng)速率較CK分別降低24.7%(pH=3.5)和45.89%(pH=2.5);單一La組水稻相對生長(cháng)速率較CK升高19.86%.La+pH 3.5組水稻相對生長(cháng)速率與CK無(wú)顯著(zhù)差異，較單一pH=3.5組升高18.03%，表明La緩解了pH=3.5 AR對水稻造成的傷害，這與周青的研究結果一致.La+pH 2.5組水稻相對生長(cháng)速率較CK降低42.47%，與單一pH=2.5 AR組無(wú)顯著(zhù)差異，表明La對pH=2.5 AR組造成的傷害未能起到緩解作用，推測可能是pH=2.5 AR嚴重破壞了水稻葉片光合系統，而此傷害已經(jīng)超出了La對光合系統的調控范圍，從而使水稻生長(cháng)受到抑制.
圖1 鑭對酸雨脅迫下水稻相對生長(cháng)速率的影響(圖中數據為平均值±標準誤差，不同字母表示各處理間差異顯著(zhù)(p<0.05)，下同)
3.2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性和胞內H+熒光強度的影響
質(zhì)膜H+-ATPase 能利用 ATP 水解釋放的能量調控細胞內H+的平衡，以維持細胞內環(huán)境的穩定.由圖 2a可知，單一AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK分別升高8.22%(pH=3.5)和降低27.40%(pH=2.5).單一La組質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK升高13.01%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK與單一pH=3.5 AR組分別升高26.03%和16.46%，推測可能是La作為一種效應物與質(zhì)子泵C末端結合，解除其自抑制功能，從而增強了質(zhì)膜H+-ATPase活力表達.La+pH 2.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性較CK降低19.86%，與單一pH=2.5 AR組無(wú)顯著(zhù)差異.質(zhì)膜H+-ATPase活性受轉錄水平的調節，pH=2.5 AR下調了質(zhì)膜H+-ATPase的轉錄水平，盡管La對質(zhì)膜H+-ATPase的轉錄水平有上調作用，但最終La+pH 2.5 AR組H+-ATPase活性降低，表明La對AR脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性的調節受AR強度的制約.
圖2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜H+-ATPase活性(a)和胞內H+熒光強度(b)的影響
胞內H+熒光強度增強表明胞內H+增多.由圖 2b可知，單一AR組水稻葉片胞內H+熒光強度較CK分別升高34.12%(pH=3.5)、69.88%(pH=2.5).單一La組胞內H+熒光強度較CK降低12.04%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片胞內H+熒光強度較CK和單一pH=3.5 AR組分別降低21.69%和41.96%，結合質(zhì)膜H+-ATPase活性變化可知，可能是由于質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，胞內過(guò)多的H+被泵至胞外，維持了細胞內環(huán)境的穩定，使水稻恢復生長(cháng).La+pH 2.5 AR組水稻葉片胞內H+較CK升高38.52%，而與單一pH=2.5 AR組無(wú)顯著(zhù)差異，分析可能是由于質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑制，大量H+在胞內積累，使水稻的生長(cháng)受到抑制.表明La調節植物耐酸性與調控質(zhì)膜H+-ATPase活性有關(guān)，調控效果受AR強度限制.
3.3 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片膜脂過(guò)氧化與質(zhì)膜脂肪酸組成的影響
CAT是植物體內重要的抗氧化酶，可以分解植物體內代謝過(guò)程中產(chǎn)生的H2O2.MDA是細胞膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量升高表示細胞膜脂過(guò)氧化程度加重.由表 1可知：?jiǎn)我籶H=3.5 AR組CAT活性、H2O2和MDA含量和較CK分別升高7.99%、12.24%和34.25%.單一pH=2.5 AR組CAT活性較CK降低40.57%，H2O2和MDA含量較CK升高44.90%和70.92%.單一La組水稻葉片CAT活性較CK升高26.43%，H2O2和MDA含量較CK分別降低32.65%和28.30%.La+ pH 3.5 AR組水稻葉片CAT活性較CK升高32.38%，H2O2和MDA含量較CK無(wú)顯著(zhù)變化，且與單一pH=3.5 AR組相比，CAT活性升高22.58%，H2O2和MDA含量分別降低19.57%和28.99%，推測可能是由于La改變了CAT的空間折疊態(tài)和卟啉活性中心的易變性，使CAT活性增強并清除體內過(guò)多的H2O2，降低了膜脂過(guò)氧化程度.La+ pH 2.5 AR組水稻葉片CAT活性較CK降低37.91%，H2O2和MDA含量較CK升高38.78%和61.51%，但與單一pH=2.5 AR組相比，3個(gè)指標均無(wú)顯著(zhù)變化.嚴重玲等研究顯示，酸雨強度越大，作物對稀土的吸收和利用越少.本研究結果顯示：在pH=2.5 AR脅迫下，水稻葉片對La的吸收和利用量減少，La未能提高CAT活性，過(guò)多的H2O2造成了膜脂過(guò)氧化，產(chǎn)生過(guò)量的MDA，而MDA可能抑制膜上蛋白的合成，進(jìn)而導致質(zhì)膜H+-ATPase活性的降低.pH=3.5 AR脅迫下，La能促進(jìn)CAT活性升高，清除過(guò)多的H2O2積累，減輕質(zhì)膜過(guò)氧化.pH=2.5 AR引起的H2O2積累不僅抑制了CAT活性，也超出了La的清除能力.
表1 鑭對酸雨脅迫水稻葉片中CAT活性、H2O2和MDA含量的影響
脂肪酸不飽和度指數可用來(lái)表征脂肪酸的不飽和程度，IUFA升高表示脂肪酸不飽和程度增加.由表 2可知，單一AR組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK分別降低5.32%(pH=3.5)和9.03%(pH=2.5);單一La組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK升高3.77%.La+pH 3.5 AR組水稻葉片質(zhì)膜IUFA較CK無(wú)顯著(zhù)差異，但較單一pH=3.5 AR組升高3.32%，結合MDA含量變化可知，La減輕了pH=3.5 AR誘發(fā)的膜脂過(guò)氧化，質(zhì)膜流動(dòng)性增強，使質(zhì)膜的功能增強，質(zhì)膜H+-ATPase活性增強.La+pH 2.5 AR組較CK降低10.08%，與單一pH=2.5 AR組無(wú)顯著(zhù)差異，推測可能是La未能減輕pH=2.5 AR誘發(fā)的膜脂過(guò)氧化，膜通透性增大，導致質(zhì)膜的功能降低甚至喪失，質(zhì)膜H+-ATPase活性降低.表明La減輕pH=3.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過(guò)氧化，進(jìn)而維持質(zhì)膜的流動(dòng)性，使質(zhì)膜H+-ATPase保持較高活性;La未能減輕pH=2.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過(guò)氧化，質(zhì)膜的流動(dòng)性降低，質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑未能緩解.
表2 鑭對酸雨脅迫下水稻葉片質(zhì)膜脂肪酸組成的影響
4 結論
1)La能緩解pH=3.5 AR對水稻生長(cháng)的傷害，對pH=2.5 AR的防護效果不明顯，顯示La對AR脅迫下水稻生長(cháng)的調節作用受AR強度限制.
2)La促進(jìn)pH=3.5 AR脅迫下質(zhì)膜H+-ATPase活性升高，減少胞內H+，緩解AR傷害;而在pH=2.5 AR脅迫下，La對質(zhì)膜H+-ATPase調控效果不明顯，大量H+在胞內積累，表明La調節植物耐酸性與調控質(zhì)膜H+-ATPase活性有關(guān)，調控效果受AR強度限制.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3)La能通過(guò)促進(jìn)CAT活性來(lái)減輕pH=3.5 AR誘發(fā)的質(zhì)膜過(guò)氧化，進(jìn)而維持了質(zhì)膜的流動(dòng)性，有助于質(zhì)膜H+-ATPase保持較高活性;pH=2.5 AR造成的活性氧積累超出了La的調控與清除能力，膜脂過(guò)氧化發(fā)生，質(zhì)膜的流動(dòng)性降低，致使質(zhì)膜H+-ATPase活性受抑.研究發(fā)現，La能改善AR脅迫對質(zhì)膜環(huán)境的影響，進(jìn)而調節質(zhì)膜H+-ATPase活性.
