低溫反硝化菌—施氏假單胞菌N3篩選及脫氮性能

　　硝酸鹽是污水處理廠(chǎng)尾水中氮的主要形式, 15 mg·L-1的總氮含量能夠滿(mǎn)足城鎮污水處理廠(chǎng)污染物排放的一級A標準, 但仍遠超2 mg·L-1的地表水環(huán)境V類(lèi)水標準.硝酸鹽的積累導致水體富營(yíng)養化, 對環(huán)境造成極大的危害.另外, 飲用水中硝酸鹽含量過(guò)高還可能會(huì )引發(fā)癌癥, 危害人體健康.因此, 對低濃度硝酸鹽水體的深度處理也日益受到重視.

　　生物脫氮是一種高效、經(jīng)濟、環(huán)保的脫氮方法, 在水體修復過(guò)程中經(jīng)常利用反硝化細菌進(jìn)行硝酸鹽的脫除.但是反硝化細菌活性受環(huán)境影響較大, 如碳源、硝酸鹽濃度、pH和溫度等.有研究表明, 低溫能夠抑制酶的活性, 減緩微生物的生長(cháng), 導致反硝化作用明顯減弱.反硝化細菌生長(cháng)的最佳溫度為25~35℃, 而我國冬季氣溫通常低于20℃, 低溫成為冬季微生物反硝化脫氮的限制性因素.目前關(guān)于反硝化細菌的研究主要集中于對硝酸鹽去除能力的提高, 對低溫限制下低濃度硝酸鹽水體中反硝化作用的研究仍然較少. Huang等報道Acinetobacter sp. Y16在實(shí)驗室低溫條件下能夠取得良好的去除效果, 但沒(méi)有進(jìn)一步考察其在水體修復長(cháng)期應用過(guò)程中的穩定性.

　　本研究分離得到1株低溫反硝化菌——施氏假單胞菌, 命名為N3.在此基礎上, 考察了初始硝酸鹽濃度、溫度, 特別是低溫對N3反硝化性能的影響.由于水體中C/N普遍較低, 碳源缺少對微生物脫氮產(chǎn)生抑制, 因此本研究分析了不同C/N對硝酸鹽去除性能的影響.

　　1 材料與方法1.1 培養基

　　溴百里酚藍培養基(BTB, g·L-1):L-天冬氨酸10; KNO3 10; KH2PO4 10; FeCl2·6H2O 0.5; CaCl2 1.5; MgSO4·7H2O 10. BTB(1%乙醇溶液)10 mL; pH 7.0~7.3.

　　反硝化培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; KNO32; MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.

　　亞硝酸鹽培養基(g·L-1):檸檬酸鈉5; KH2PO4 1; K2HPO4 1; NaNO22(過(guò)濾除菌); MgSO4·7H2O 0.2. pH 7.2~7.5.

　　1.2 菌株的分離和鑒定

　　將10 mL泥水混合物轉移到100 mL反硝化培養基中, 15℃下連續富集培養.將富集培養后的菌液系列稀釋, 分別取10-4、10-5、10-6、10-7濃度下菌液200 μL, 均勻涂布到BTB平板上, 反復分離純化后挑取藍色單菌落, 進(jìn)行后續研究.

　　基于菌株的16S rDNA序列進(jìn)行菌種鑒定.菌體總DNA參照EasyPure Genomic DNA Kit(北京全式金生物工程有限公司)的方法進(jìn)行提取.采用細菌通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行擴增, PCR反應體系(50 μL): 10×Buffer 5.0 μL, dNTPs 4.0 μL, 上游引物和下游引物各1.0 μL, 重蒸水38 μL, 離心混勻后加入DNA模板0.5 μL, Taq酶0.5 μL. PCR反應條件:① 94℃預變性5 min; ② 94℃變性50 s; ③ 52℃退火60 s; ④ 72℃延伸90 s; ⑤ 72℃, 10 min; ②~④步驟循環(huán)30次. PCR產(chǎn)物純化后交由上海生工生物有限公司進(jìn)行測序.

　　將獲得的細菌16S rDNA序列(MF521886)提交到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov), 利用Blast進(jìn)行比對, 并結合已有研究中得到驗證的相關(guān)反硝化細菌序列, 進(jìn)行同源性比較.利用MEGA7.0軟件進(jìn)行多序列比對分析, 并用Neighbor-Joining法構建系統發(fā)育樹(shù).

　　1.3 理化指標分析方法

　　亞硝酸鹽、硝酸鹽、總氮的濃度分別按照N-(1-萘基)-乙二胺光度法、紫外分光光度法、過(guò)硫酸鉀氧化-紫外分光光度法測定, 儀器采用UV 5200紫外/可見(jiàn)分光光度計.去除率按照以下公式計算:

　　式中, ci代表初始氮濃度(mg·L-1), ct代表終態(tài)氮濃度(mg·L-1).

　　1.4 NarG、nirS和nosZ基因的擴增

　　反硝化功能基因narG、nirS和nosZ的擴增引物和條件見(jiàn)表 1, 得到的PCR產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

　　表 1 PCR擴增過(guò)程中的引物和程序設計

　　1.5 環(huán)境條件對反硝化功能的影響

　　分別調節C/N為4、8和12, 溫度為4、10、20、30、40、50和60℃, 初始硝酸鹽濃度為15、30、40、50、60、70、80、90和100 mg·L-1, 研究不同C/N、溫度、硝酸鹽濃度對反硝化過(guò)程的影響.每個(gè)實(shí)驗均設3個(gè)平行, 同時(shí)設空白實(shí)驗作對照.除上述單因素影響實(shí)驗外, 硝酸鹽初始濃度為15 mg·L-1, 反應溫度為30℃, C/N=8.

　　1.6 低溫對反硝化功能及基因表達的影響

　　分別于4、10和15℃下, 定時(shí)檢測硝酸鹽的去除情況.在4、10和30℃條件下, 分別在反應36 h時(shí)取一定量的菌液, 6 000 r·min-1離心5 min, 棄上清, 用適量無(wú)菌生理鹽水重懸, 調節D600為1.各自吸取2 mL菌液, 用Trizol法(北京全式金生物有限公司)提取基因組RNA, 用PrimeScriptTMRT reagent Kit(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行反轉錄, 隨后利用SYBR Premix Ex TaqⅡ(大連寶生物工程有限公司)進(jìn)行定量PCR, 對narG、nirS基因的表達活性進(jìn)行檢測.實(shí)驗中用到的引物和反應條件詳見(jiàn)表 1.

　　1.7 低溫下固定化反硝化菌的運行穩定性實(shí)驗

　　用10 mL菌體含量為0.2 g的濕菌體與10%的PVA和1%的SA溶液混合均勻, 緩慢滴入1% CaCl2飽和硼酸溶液中, 4℃交聯(lián)24 h進(jìn)行固定化, 制備得到直徑為0.5 cm左右的均勻小球.將固定化后的N3投加到垂直流裝置中, 采用人工配制的低污染水(水質(zhì)指標見(jiàn)表 2), 以2~3 d為一個(gè)進(jìn)水周期, 在10℃下進(jìn)行半連續實(shí)驗.初始C/N=8, 穩定運行4個(gè)周期后, C/N調為4.每12 h定時(shí)取樣, 檢測硝酸鹽的去除.

　　表 2 人工配制的低污染水基本水質(zhì)指標

　　2 結果與討論2.1 菌株的分離和鑒定

　　在15℃時(shí), 采用反硝化培養基經(jīng)連續富集培養、BTB平板篩選, 得到1株反硝化細菌.它能夠在36 h內將硝酸鹽完全去除, 且沒(méi)有亞硝酸鹽的積累, 命名為N3.

　　菌株N3在富集培養基平板上培養24 h, 菌落呈圓形, 淡黃色, 半透明狀, 邊緣光滑.細胞為短桿狀, 大小為(1.5~2.0 μm)×(0.8~1.5 μm), 革蘭氏染色呈陰性.系統發(fā)育樹(shù)如圖 1所示, 菌株N3與施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)在同一分支, 同源性達99%, 可初步鑒定為施氏假單胞菌.

　　圖 1

圖 1 基于N3的16S rDNA序列和其他相關(guān)序列構建的系統發(fā)育樹(shù)

　　為進(jìn)一步驗證N3的反硝化能力, 對N3進(jìn)行了反硝化功能基因的檢測.由圖 2可見(jiàn), 反硝化功能基因narG、nirS和nosZ均成功地從N3基因組中得到擴增.

　　圖 2

圖 2 反硝化過(guò)程中功能基因narG、nirS及nosZ的擴增

　　NarG基因編碼膜結合硝酸鹽還原酶, 能夠在缺氧條件下催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽, 是反硝化過(guò)程的第一步.生成的亞硝酸鹽進(jìn)一步被還原為NO, 這是反硝化過(guò)程中的限速步驟, 因此編碼亞硝酸鹽還原酶的基因nirS和nirK被認為是區分反硝化和其它氮還原過(guò)程的關(guān)鍵基因. Heylen等的研究表明, 相比nirK, 由nirS編碼的亞硝酸鹽還原酶更容易接受電子, 進(jìn)行反硝化. N3中nirS的存在部分解釋了菌株N3所具有的高效反硝化能力.尤其重要的是N3中含有nosZ基因, 其編碼的氧化亞氮還原酶能夠催化N2O轉化為N2, 這表明利用N3進(jìn)行反硝化脫氮能夠減少溫室氣體N2O的釋放.

　　2.2 不同環(huán)境因子對反硝化作用的影響2.2.1 不同C/N對反硝化作用的影響

　　水體中的硝酸鹽不僅能夠通過(guò)反硝化作用從水體中脫除, 還可以通過(guò)微生物同化作用轉化為自身生物量, 或者經(jīng)異化還原作用重新以銨根離子的形式釋放到水體中.因此僅憑硝酸鹽濃度的減少不能判斷為反硝化脫氮, 還需與水體中總氮的去除效果進(jìn)行比較.如圖 3, 在C/N為8和12時(shí), N3在8 h即可實(shí)現總氮的完全去除; 當C/N=4時(shí), 14 h亦可實(shí)現90%的總氮去除率.這與水體中硝酸鹽的去除效果基本一致, 表明N3主要通過(guò)反硝化作用完成整個(gè)脫氮過(guò)程.

　　圖 3

圖 3 不同C/N下硝酸鹽與總氮的去除及亞硝酸鹽的積累

　　在微生物反硝化過(guò)程中, 碳源不僅為菌體生長(cháng)提供能量, 也是硝酸鹽還原的主要電子來(lái)源.目前我國污水處理廠(chǎng)尾水中C/N普遍較低, 在對尾水進(jìn)行進(jìn)一步處理時(shí), 碳源供應不足嚴重抑制了反硝化細菌的生長(cháng), 導致硝酸鹽去除率不高. Taylor的研究發(fā)現Providencia rettgeri YL在C/N=10時(shí)去除性能最佳, Chen等也得出了相似的結論.而本研究得到的菌株N3在C/N=8時(shí)去除效果最佳, 在8 h內即可完全去除硝酸鹽, 平均去除速率為1.87 mg·(L·h)-1.當C/N進(jìn)一步增加到12時(shí), 去除率并沒(méi)有太大變化, 甚至出現輕微下降, 這與Joo等的研究結果相一致, 可能是因為此時(shí)菌體生長(cháng)所需的能量充足, 碳源成為非限制性因素(圖 3).即使在C/N=4時(shí), N3在14 h內仍可達到90%的去除率, 能夠滿(mǎn)足低C/N水體中硝酸鹽去除的需要.在2~8 h存在亞硝酸鹽積累的峰值, 但其積累量低于0.1 mg·L-1, 并迅速降低.這可能是因為反硝化過(guò)程中氧化還原電位高的硝酸鹽對電子的競爭能力大于亞硝酸鹽, 從而導致少量亞硝酸鹽的積累, 與李衛芬等的研究結果相一致.

　　當以亞硝酸鹽為唯一氮源時(shí), 總氮與亞硝酸鹽的去除基本一致, 表明N3可以利用亞硝酸鹽為底物進(jìn)行反硝化.如圖 4所示, N3在C/N為8和12時(shí)均能在6 h內將硝酸鹽完全去除.在C/N=4時(shí), N3反硝化速率相對較慢, 但8 h后脫氮率仍能達到95.54%.總之, N3可利用硝酸鹽和亞硝酸鹽為底物進(jìn)行代謝, 這與牟東陽(yáng)等[22]的實(shí)驗結果一致.上述結果表明, N3能在短時(shí)間內實(shí)現良好的反硝化效果, 對低C/N水體中硝酸鹽的去除具有重要意義.

　　圖 4

圖 4 不同C/N下亞硝酸鹽和總氮的去除率

　　2.2.2 不同硝酸鹽濃度對反硝化作用的影響

　　作為反硝化作用的底物, 硝酸鹽對反硝化過(guò)程產(chǎn)生重要影響. Mulholland等的研究表明, 隨著(zhù)硝酸鹽濃度增加, 反硝化脫氮量也隨之增加, 但是氮去除速率卻呈現下降趨勢.在水體修復過(guò)程中, 經(jīng)常出現水體受外界沖擊, 硝酸鹽負荷過(guò)高的情況, 因此有必要研究硝酸鹽濃度對N3反硝化過(guò)程的影響.

　　如圖 5所示, 在硝酸鹽濃度低于70 mg·L-1時(shí), N3能夠在48 h內將硝酸鹽完全去除.隨著(zhù)硝酸鹽濃度繼續增加, 去除率略有下降.可能是由于高滲透壓對微生物的活性產(chǎn)生抑制作用.另外, 消耗的碳源也隨著(zhù)硝酸鹽濃度的增加而增加, 最終因電子供應不足導致硝酸鹽不能被完全還原, 去除效果下降.在硝酸鹽濃度為100 mg·L-1時(shí), N3仍然能夠實(shí)現80%的脫氮率, 脫氮效果良好.總體看來(lái), 硝酸鹽濃度低于100 mg·L-1時(shí), N3受硝酸鹽濃度影響不大, 能夠滿(mǎn)足水體中硝酸鹽去除的需要.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 5

圖 5 不同硝酸鹽濃度下菌株N3在48 h后的硝酸鹽去除效果

　　2.2.3 不同溫度對反硝化作用的影響

　　長(cháng)期以來(lái), 溫度一直被認為是影響反硝化作用的重要因素.在適宜的溫度范圍內, 溫度越高, 微生物生長(cháng)越快, 酶活性也越高.一般來(lái)說(shuō), 溫度低于20℃時(shí), 對微生物表現出明顯的抑制作用.在10℃時(shí)Pseudomonas stutzeri YZN-001和Bacillus sp. strain YX-6幾乎不生長(cháng), 而N3在4℃時(shí)仍然具有40%以上的去除率(圖 6).且在50℃高溫時(shí), 仍然能夠去除80%以上的硝酸鹽.當溫度繼續升高到60℃時(shí), 去除率只有30%, 可能是因為高溫破壞酶的結構, 抑制細胞正常的代謝活動(dòng), 導致去除率下降.在4~30℃范圍內, N3的硝酸鹽去除速率由0.27 mg·(L·h)-1上升到0.63 mg·(L·h)-1.當溫度繼續升高, 速率保持不變, 直至60℃時(shí), 反應速率下降到0.23 mg·(L·h)-1, 這與其去除率的變化保持一致.李衛芬等篩選得到的反硝化細菌F1在溫度低于25℃或高于35℃時(shí)菌株的生長(cháng)即受到抑制.相比之下, N3在4~50℃范圍內均能實(shí)現40%以上的去除率, 具有更寬廣的溫度適應范圍.尤其重要的是, N3對低溫的適應性為冬季水體中硝酸鹽的去除提供了一個(gè)潛在解決方案.

　　圖 6

圖 6 不同溫度條件下的硝酸鹽去除效果

　　2.3 N3對低溫的適應性2.3.1 低溫下N3的硝酸鹽去除效果及反硝化功能基因的表達檢測

　　低溫對酶的活性有強烈的抑制作用, 進(jìn)而影響微生物的生長(cháng)和代謝, 導致反硝化細菌冬季脫氮效果不理想[2].如圖 7所示, 在剛開(kāi)始的20 h, N3對低溫有一個(gè)適應期, 硝酸鹽去除表現出延滯作用.隨后去除率迅速增加, 最終在36 h內實(shí)現對硝酸鹽的完全去除.冬季人工濕地水力停留時(shí)間一般在2~10 d, 良好的低溫適應性使得N3成為冬季人工濕地中反硝化脫氮的候選菌株, 具有良好的應用前景.

　　圖 7

圖 7 N3在4、10及15℃下對硝酸鹽的去除 

　　采用定量PCR技術(shù)對反硝化基因narG、nirS在4、10與30℃條件下的表達進(jìn)行檢測, 結果如圖 8所示.在各溫度下, narG的基因豐度在2.03×108~2.99×108 copies·mL-1之間, nirS的基因含量在2.27×108~2.83×108 copies·mL-1之間, 各溫度之間相差不大.而對于基因表達來(lái)說(shuō), 4℃和10℃下, narG的表達量在1.74×107~1.95×107 transcripts·mL-1菌液之間, nirS的表達量在1.56×107~1.74×107 transcripts·mL-1菌液之間, 為30℃下表達量的1/3~1/2.低溫通過(guò)抑制反硝化基因的表達影響菌的生長(cháng)和酶的活性, 進(jìn)而導致反硝化速率的下降, 但是反硝化能力的高低還可能與mRNA的壽命及蛋白質(zhì)的活性等有關(guān), 需要進(jìn)一步地研究進(jìn)行驗證.

　　圖 8

圖 8 4、10及30℃條件下narG及nirS的基因豐度及表達情況

　　2.3.2 低溫下固定化反硝化菌的運行穩定性實(shí)驗

　　在實(shí)驗室條件下, N3具有良好的低溫反硝化效果.但是游離菌對不良環(huán)境抵抗力差, 容易流失, 在水體修復過(guò)程中具有一定的局限性.固定化技術(shù)能有效提高微生物對不良條件的抗性, 防止菌種流失.本研究采用PVA和SA對N3進(jìn)行固定化, 進(jìn)行低溫半連續實(shí)驗.

　　如圖 9所示, 在運行的前4個(gè)周期內, 單個(gè)周期內反硝化細菌12 h的脫氮率即達到50%, 24 h去除率大于90%.調整C/N=4后, 初期受低濃度碳源的限制, 硝酸鹽去除效果較之前有所下降, 但仍能實(shí)現90%的去除率.運行15 d后, 硝酸鹽的去除達到穩定, 去除率始終保持在95%以上, 具有良好的穩定性.另外, 經(jīng)固定化N3處理后的水體始終清澈, 沒(méi)有因反硝化產(chǎn)氣而破裂, 也觀(guān)察不到菌體外泄現象, N3始終保持較好的活性.在連續運行的54 d內固定化N3保持良好的機械強度及去除穩定性, 能夠滿(mǎn)足水體處理的需要.

　　圖 9

圖 9 固定化反硝化菌的半連續實(shí)驗

　　3 結論

　　(1) 從富營(yíng)養化水體中分離得到1株低溫反硝化細菌N3, 革蘭氏陰性菌.菌株鑒定結果表明, N3為施氏假單胞菌.

　　(2) 菌株N3在C/N=8, 硝酸鹽濃度低于70 mg·L-1時(shí), 能實(shí)現硝酸鹽的完全去除. N3具有良好的低溫適應性, 4℃時(shí)可在36 h內實(shí)現對15 mg·L-1硝酸鹽的完全去除; 反硝化基因narG、nirS的表達與30℃處于同一個(gè)數量級.在10℃下的低溫半連續實(shí)驗中, 固定化N3在運行的54 d中無(wú)菌體外泄情況且去除效果穩定, 可作為低溫低C/N下的反硝化候選菌株, 對于冬季水體中硝酸鹽的去除具有良好的應用潛力.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：路俊玲)