水質(zhì)富營(yíng)養化研究處理

　　1 引言

　　近些年，藻類(lèi)水華事件常有報道.其中，硅藻水華自1992年春季在我國漢江下游爆發(fā)后，幾乎每年春季漢江中下游江段均會(huì )暴發(fā)不同程度的水華.2005—2011年，嘉陵江流域間斷性爆發(fā)硅藻水華，70%~80%的藻類(lèi)屬于針桿藻，水體渾濁，溶解氧降低，對水源質(zhì)量造成了巨大的破壞;且水廠(chǎng)出現硅藻嚴重堵塞濾池的現象，導致水處理量減小，出廠(chǎng)水質(zhì)變差.

　　目前除了常規的物理除藻方法，研究最多的是化學(xué)控藻技術(shù).Daly等研究銅綠微囊藻最高細胞密度為30×104 cells · mL-1時(shí)，氯作用在7～29 mg · min · L-1 之間(在水廠(chǎng)正常的消毒劑量范圍內)，所有藻細胞失活;但是已經(jīng)有大量的研究證明氯法殺藻會(huì )引起水中三鹵甲烷(THMs)等消毒副產(chǎn)物的產(chǎn)生，因此該方法已經(jīng)正在逐漸被其他除藻藥劑代替.Chen等研究了高錳酸鉀預氧化能很好提高絮凝對藻去除率的機理，而Petrusěvski 等的研究也指出高錳酸鹽的使用劑量與殘余錳量是呈正相關(guān)的，因此發(fā)生水華時(shí)投加高錳酸鹽很有可能會(huì )造成水源中錳超標，硫酸銅的使用也有此類(lèi)問(wèn)題.劉海龍等用1.0 mg · L-1的臭氧預氧化使藻的去除率從常規混凝沉淀后水的55%~85%上升到95%左右，但高投加量(≥2.0 mg · L-1)的預氧化，會(huì )影響有機物的去除;Coral等研究直接使用臭氧作用于細胞密度為25×104和150×104 cells · mL-1 的銅綠微囊藻藻液，在作用CT值都小于0.2 mg · min · L-1 時(shí)，所有細胞即失活;可看出臭氧除藻的效果很好，但是存在的問(wèn)題是制備臭氧的設備成本很高，在國內很難應用于實(shí)踐.Huang等從劑量、接觸時(shí)間和pH值等方面研究表明二氧化氯對藻的去除效果優(yōu)于或等同于液氯的去除效果;Zhou等研究將二氧化氯直接作用細胞密度為100×104 cells · mL-1銅綠微囊藻，在二氧化氯濃度1.0 mg · L-1作用10 min，藻細胞去除率達到91.5%.

　　目前我國關(guān)于除藻技術(shù)的研究以藍藻為主，較少有硅藻殺滅的研究，因此本文以硅藻門(mén)中的針桿藻為例，利用大氣壓強電離放電高效生成的· OH，注入到處理高藻水的主管路中，進(jìn)行水華典型藻針桿藻的殺滅研究.采用以SYTOX Green熒光染色結合熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測藻細胞活性、光合活性參數Fv/Fm值分析藻細胞光合能力，這3種方法來(lái)確定· OH致死針桿藻的閾值濃度和閾值濃度下的致死時(shí)間.

　　2 材料和方法

　　2.1 實(shí)驗材料

　　藻種及培養：實(shí)驗所用的藻種購自中科院武漢水生所.針桿藻(FACHB-843，Synedra sp.)：屬硅藻門(mén)羽紋綱無(wú)殼縫目，細胞長(cháng)桿形，長(cháng)10 μm左右，殼面披針形，中部寬，從中間到兩端逐漸狹窄;色素體帶狀，位于細胞的兩側、片狀，2個(gè)，每個(gè)色素體常具有3個(gè)到多個(gè)蛋白核.培養基為Erdschreiber，培養條件為(25±1)℃，pH=7.0±0.1，光照2000 lx，光期 ∶ 暗期=12 ∶ 12.利用顯微鏡計數對藻細胞密度進(jìn)行監測，同時(shí)測吸光度，待進(jìn)入對數生長(cháng)期，進(jìn)行實(shí)驗.

　　實(shí)驗用水是由純水機制備的去離子水，用于調節系統參數制備所需濃度的TRO溶液和配制藻液.

　　2.2 實(shí)驗系統

　　· OH處理高藻水的實(shí)驗系統如圖 1所示.待處理藻液由水泵泵入管路，進(jìn)水流量為4 L · min2-1，純度為99.9%的O2通入氧等離子體發(fā)生器中(圖 2)，流量為0.5 L · min-1.在大氣壓下微流注與微輝光交替協(xié)同形成的強電離放電作用下，O2被電離，生成O+、O(21D)、O、O-、O2(a21Δg)、O3等氧活性粒子;然后在高壓射流器處，經(jīng)射流、空穴作用將氣態(tài)氧活性粒子高效傳質(zhì)混溶于水溶液中，生成以· OH為主的氧自由基溶液，其中還包括H2O2、HO-、O2· -，

　　圖1 · OH處理高藻水的實(shí)驗系統

　　圖2 等離子體發(fā)生器構造圖

　　O2· -、HO3 ·和O2+H2O等自由基，將這些氧自由基統稱(chēng)為總氧化劑TRO，使用在線(xiàn)檢測儀(ATi Q45H，美國)對管路中的TRO濃度進(jìn)行測定.TRO溶液在管路中作用于藻細胞，進(jìn)行快速高效地殺滅.管路中設置不同的取樣點(diǎn)，作用時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 s，以研究不同作用時(shí)間的殺滅效果.

　　2.3 檢測方法

　　2.3.1 總氧化劑TRO(Total

　　reactive oxidant)濃度檢測 TRO是以· OH為主，包括H2O2、HO2-、O23· -、O· -、HO3 ·和O2+H2O等氧自由基的總氧化劑，使用在線(xiàn)監測儀(ATi Q45H，美國)對TRO濃度進(jìn)行測定，同時(shí)使用DPD(N，N-二乙基對苯二胺)分光光度法對濃度進(jìn)行校正，該方法根據USEPA標準330.5建立，使用紫外可見(jiàn)分光光度儀(Bioquest CE2501，英國)測定.

　　2.3.2 藻細胞活性分析

　　本實(shí)驗采用熒光染色法結合熒光顯微鏡計數和流式細胞儀來(lái)定量分析藻細胞活性，這些方法已廣泛應用于分析細菌、胞子和藻細胞活性.熒光染料為SYTOX�q Green(Life Technologies，美國)核酸染色劑，當細胞膜受損，染色劑通過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞，與DNA結合，可在488 nm波長(cháng)激發(fā)后發(fā)出綠色熒光;對于活細胞，染色劑不能通過(guò)細胞膜而不會(huì )被染色.

　　于暗室內染色，使用熒光顯微鏡(Nikon 90i，日本)和0.100 mL 100格的藻類(lèi)計數框(20 mm×20 mm)，進(jìn)行觀(guān)察計數.涂片靜置，放大400倍，分別在自然光和藍色激發(fā)光下觀(guān)察細胞，對沒(méi)有發(fā)出綠色熒光的完整細胞進(jìn)行計數.以1行(即10格)為1個(gè)計數單位進(jìn)行計數，所計細胞數目≥100 cells.

　　于暗室內染色，樣品經(jīng)流式細胞儀(Beckman Coulter Gallios，美國)488 nm的波長(cháng)激發(fā)，細胞發(fā)出的熒光信號會(huì )分別被FL1(525 nm)和FL3(620 nm)通道收集.激發(fā)后發(fā)出的綠色熒光，在FL1通道被收集;同時(shí)細胞內葉綠素發(fā)出的紅色熒光會(huì )被FL3通道收集.

　　2.3.3 藻細胞的光合能力分析

　　光合參數Fv/Fm值，表示藻細胞光合反應中心PS II的最大光量子產(chǎn)量，反映了植物的最大潛在光合能力.該值越大說(shuō)明光和潛力越大.樣品經(jīng)10 min的暗適應，使用浮游植物熒光儀(PHYTO-PAM Walz，德國)和Photo win v2.13(ED)操作軟件測定.經(jīng)過(guò)充分暗適應后，所有電子門(mén)均處于開(kāi)放態(tài)，打開(kāi)測量光得到最小熒光F0，此時(shí)給出一個(gè)飽和脈沖，所有的電子門(mén)就都將該用于光合作用的能量轉化為了熒光和熱，此時(shí)得到的最大熒光Fm，根據Fm和F0可以計算出Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm.

　　3 結果與分析 3.1 采用熒光顯微鏡計數確定致死閾值

　　實(shí)驗中對初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液在實(shí)驗系統中進(jìn)行殺滅.對于某一藻密度的藻液，改變TRO濃度，利用熒光顯微鏡測定藻細胞的存活率(c/c0).得到不同初始藻密度的藻細胞存活率與TRO濃度的關(guān)系曲線(xiàn)，如圖 3所示.可看出，隨著(zhù)TRO濃度的不斷升高，藻細胞存活率隨之降低;在相同的TRO濃度下，藻類(lèi)的初始濃度越高，存活率越低.因此使不同的初始藻密度的藻細胞完全致死所需的TRO濃度是不同的.隨著(zhù)藻液初始藻密度的升高，所需要的致死劑量也隨之升高.致死劑量由低到高分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1.

　　圖3 藻細胞存活率(c/c0)與TRO濃度的關(guān)系曲線(xiàn)

　　分析比較初始密度增大的倍數與對應的TRO致死劑量增大的倍數，發(fā)現TRO致死劑量增大的倍數均小于初始密度增大的倍數.如初始藻密度10×104 cells · mL-1分別增大到5、10倍，而對應的TRO致死劑量明顯小于5、10倍.推測溶液中· OH占總氧化劑的比例隨TRO濃度的增加而增加，從而導致所需的TRO劑量相對減少.

　　初始藻密度為100×104 cells · mL-1的藻液，在致死閾值下經(jīng)· OH處理.在顯微鏡下，放大400倍，分析處理前后藻細胞形態(tài)的變化.在自然光下，處理前，藻細胞通體周圓，細胞壁光滑完好，胞內結構分布清晰，顏色鮮亮稠密;處理后，藻細胞外形基本沒(méi)有變化，但顏色暗淡，胞內分布模糊.在熒光下，處理前藻細胞發(fā)出紅色的葉綠素自體熒光，無(wú)綠色熒光;處理后細胞核發(fā)出強烈的綠色熒光，證明細胞失活，染色劑通過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞，與細胞核中的DNA結合，使細胞核染色.

　　以上現象均可看出在較低的致死閾值作用下，細胞失活后外形沒(méi)有大的變化，更沒(méi)有出現裂解.

　　3.2 采用光合能力確定致死閾值

　　作為一種自養型生物，硅藻需要自身的光合反應系統，包括光合反應系統Ⅰ(PSⅠ)和光合反應系統Ⅱ(PSⅡ)完成能量轉換.這種脈沖式調制熒光測定技術(shù)(PAM)是基于測定葉綠素熒光的原理，是一種表征光合反應系統的性能，特別是PSⅡ的活性的強有力的手段.對PSⅡ反應中心的損傷不僅會(huì )引起光抑制作用，固碳作用受損和生長(cháng)速率降低.目前已有研究表明利用該方法測得的Fv/Fm值可作為預測藻類(lèi)生長(cháng)趨勢的參數.

　　初始細胞密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的藻液，測定經(jīng)過(guò)不同TRO濃度作用后藻液的光合參數Fv/Fm值，分析藻細胞光合能力的變化情況，處理前藻液的Fv/Fm值為0.50左右，處理后隨著(zhù)TRO濃度的增大而減小，Fv/Fm值降低為0，說(shuō)明此時(shí)的藻細胞已經(jīng)不能進(jìn)行光合作用，藻細胞已無(wú)生長(cháng)能力.此時(shí)的TRO濃度即為致死閾值，分別為0.30、0.75、1.20 mg · L-1.

　　3.3 采用流式細胞技術(shù)確定致死閾值濃度

　　初始藻密度為100×104cells · mL-1，利用流式細胞儀分析不同TRO濃度與藻細胞致死情況的關(guān)系，橫坐標FL1-A對應于染色劑與細胞核酸結合后發(fā)出的綠色熒光強度，縱坐標FL3-A對應于葉綠素的自發(fā)紅色熒光強度.區域Q1的FL1信號較弱，而FL3信號較強，說(shuō)明此區域為活細胞所在區域.比較對照組和處理組，細胞團由區域Q1逐漸向右下方即區域Q2和Q3移動(dòng)，即綠色熒光增強，葉綠素熒光減弱.證明細胞失活，被SYTOX Green染色，同時(shí)葉綠素也遭到破壞.由對照組到TRO濃度依次增大為0.61、0.83、1.18 mg · L-1，區域Q1的活細胞占全部檢測細胞的比例由原始的93.6%依次減小為16.5%、1.21%、0.265%(圖 4a~d)，說(shuō)明存活細胞隨TRO濃度的增大而減少.

　　3.4 · OH對針桿藻的致死時(shí)間探究

　　分別在致死閾值濃度0.30、0.75、1.20 mg · L-1時(shí)，將初始藻密度分別為10×104、50×104、100×104 cells · mL-1的針桿藻藻液通入殺藻實(shí)驗系統(圖 1).將高壓射流器處藻液與氧等離子體剛開(kāi)始混合時(shí)，設為0 s，分別依次于不同作用時(shí)間(分別為1、2、3、4、5、6 s)的取樣口取樣，同時(shí)用過(guò)量的飽和硫代硫酸鈉終止反應.檢測每一樣品的Fv/Fm值，結果可看出，Fv/Fm值均在1 s內快速由0.50減小為0(儀器顯示為不能檢出).說(shuō)明在高壓射流器處到1 s取樣口之間，發(fā)生了氧等離子體與水分子快速生成· OH并進(jìn)行劇烈的生化反應.

　　3.5 討論

　　3.5.1 致死閾值的確定

　　分析3種確定致死閾值的方法，可知用熒光顯微鏡觀(guān)察計數比較直觀(guān)，可得到細胞存活數量，得到的結果比較穩定可靠，致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1;而通過(guò)光合參數Fv/Fm值的變化確定的致死閾值(0.30、0.75、1.20 mg · L-1)與顯微鏡計數確定的致死閾值相差很小，分別為0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合;采用流式細胞儀分析處理前后不同通道接收的熒光強度的變化來(lái)確定致死閾值，這種方法存在的問(wèn)題是，只能得到活細胞的百分比例，無(wú)法得知具體的數目，而且結果的準確度與分析者的熟練程度有很大關(guān)系.本實(shí)驗中初始藻密度為100×104 cells · mL-1，在致死閾值1.18 mg · L-1下，使用流式細胞儀分析后，仍有約2560 cells · mL-1的活細胞，由于實(shí)驗分析方法的局限，無(wú)法使致死率達到100%，因此該方法確定的致死閾值要大于使用計數法確定的致死閾值.

　　3.5.2 ·

　　OH對針桿藻的殺滅效果 本實(shí)驗中在致死閾值下，1 s內使光合參數Fv/Fm由0.50減小為0，使100×104cells · mL-1藻液中的藻細胞失活的CT值約為0.02 mg · min · L-1，Li等(Li et al.， 2014)的研究水力空化作用1 min，產(chǎn)生· OH的濃度為(0.67±0.03)μmol · L-1，立即測定光合參數由0.33降低為0.31，變化很小;Ou等的研究結果為KMnO4作用2 h，光和潛力由0.45減低到0.07;Zhou等的研究結果為2.5 μmol · L-1(即0.4 mg · L-1)CuSO4及0.5 mmol · L-1(即17 mg · L-1)H2O2分別作用48 h后，光合參數分別由處理前約0.42減小為約0.05.Daly等利用流式細胞儀來(lái)定量分析氯對藻細胞的致死率，研究中也發(fā)現藻細胞數量增多，致死率達100%時(shí)的需氯量也隨之增加;氯作用的CT值在7 mg · min · L-1以上，可使30×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細胞完全致死;Zhou等的研究中發(fā)現可使100×104 cells · mL-1的銅綠微囊藻藻細胞在1 mg · L-1的二氧化氯作用10 min后(CT值約為10 mg · min · L-1)致死率達到91.5%.相比之下，本實(shí)驗條件下得到的反應時(shí)間是其他普通氧化劑的1/60以下，CT值為其他氧化劑的1/100以下，說(shuō)明· OH有強烈的氧化性和極高的氧化反應速率，其氧化還原電位(2.8 V)接近氟的氧化還原電位，反應無(wú)選擇性;而且反應速率高達109 mol · L-1 · s-1，比其他氧化劑的高107倍，可使生化反應在ms級內進(jìn)行.

　　4 結論

　　1)初始藻密度分別為10×104、50×104和100×104 cells · mL-1的藻液，采用熒光顯微鏡計數和光合能力的變化確定的致死閾值分別為0.25、0.71、1.18 mg · L-1及0.30、0.75、1.20 mg · L-1，分別相差0.05、0.04、0.02 mg · L-1，基本吻合.而采用流式細胞儀分析確定致死閾值時(shí)，無(wú)法使致死率達到100%，因此無(wú)法確定致死閾值.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　2)在致死閾值下，光合參數Fv/Fm值1 s內減小為0，藻細胞喪失光合能力和生長(cháng)潛力.