1 引言
多氯聯(lián)苯已被確定為“三致”物質(zhì)，具有難降解性、生物毒性、生物蓄積性和遠距離遷移性等，對人類(lèi)生存繁衍和可持續發(fā)展構成嚴重威脅.我國已禁止多氯聯(lián)苯的生產(chǎn)和使用，但早期使用及處置較為粗放，某些特定地區依然存在較為嚴重的土壤PCBs污染.
用生物處理法修復PCBs污染土壤操作簡(jiǎn)便、修復費用低，可徹底降解污染物，且不會(huì )產(chǎn)生二次污染.有研究報道，用Sinorhizobium meliloti菌株降解三氯聯(lián)苯2，4，4′-TCB，6 d降解率達到77.4%(Tu et al., 2011);用Stenotrophomonas maltophilia菌株降解四氯聯(lián)苯PCB52，7 d的降解率可達52.9%.但在受到PCBs污染的土壤中，常常有重金屬污染同時(shí)存在，重金屬對微生物降解PCB的生化過(guò)程有抑制作用.
本研究通過(guò)土著(zhù)微生物篩選馴化，研究其對四氯聯(lián)苯PCB77降解能力及影響因素，并分析其受重金屬脅迫下的降解效率.
2 材料與方法
2.1 研究對象與菌株篩選
本文選擇四氯聯(lián)苯PCB77為研究對象，其化學(xué)名為3，3′，4，4′-Tetrachlorobiphenyl，化學(xué)結構見(jiàn)圖 1.采用富集分離的培養方式，從長(cháng)期受有機物污染的土壤中篩選獲得1株能以PCB77為唯一碳源生長(cháng)、具有較寬泛環(huán)境適應能力及較高降解效率的菌株，經(jīng)16S rDNA鑒定為銅綠假單胞菌(Pseudomonas sp.)，命名為JXJ.利用聯(lián)苯為底物馴化其降解PCB77的能力，并對其生長(cháng)和不同條件下降解PCB77特性研究.
圖1 PCB77化學(xué)結構式
2.1 主要儀器及試劑
實(shí)驗所用標準品為PCB77(3，3′，4，4′-四氯聯(lián)苯)(美國Accust and ard);正己烷為色譜純級，其余試劑均為分析純.主要涉及儀器有氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國安捷倫)，智能精密搖床(上海博訊)、隔水式恒溫培養箱(上海博訊)、潔凈工作臺(上海博訊)及滅菌鍋(上海三申)等.
2.2 主要溶液及培養基
土壤初步馴化營(yíng)養液由5 g葡萄糖、1 g磷酸二氫鉀、2 g尿素、10 g聯(lián)苯和10 L蒸餾水配制.
用5.0 g牛肉膏、10.0 g蛋白胨、5.0 g NaCl、1000 mL蒸餾水，在pH=7.0條件下配制富集培養基;固體培養基再加入15 g · L-1的瓊脂，121 ℃滅菌30 min備用.
用0.5 g磷酸氫二鉀、0.5 g磷酸二氫鉀、1.0 g硫酸銨、0.2 g硫酸鎂、0.1 g氯化鈣、0.2 g氯化鈉、1000 mL蒸餾水，在pH=7.0條件下配制無(wú)機鹽培養基(MSM);固體培養基再加15 g · L-1的瓊脂，121 ℃滅菌30 min備用.
2.3 多氯聯(lián)苯降解菌的篩選及鑒定馴化
2.3.1 降解菌初步馴化、分離
采用規格為30 cm×30 cm ×20 cm的自制有機玻璃盒作為初步馴化裝置，底層鋪有高度約為2 cm的沙層，沙層上鋪2 cm礫石，礫石層上鋪有約8 cm取自某化工廠(chǎng)的有機污染土壤.定期加入含有聯(lián)苯濃度為1000 mg · L-1的初步馴化營(yíng)養液，定期翻動(dòng)土壤，保持一定的土壤濕度，并控制土壤pH值在6.5～7.5之間，馴化1個(gè)月.取上述初步馴化過(guò)的土壤1 g，50 mL滅菌液體富集培養基，裝入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1條件下振蕩培養.待培養液發(fā)生渾濁時(shí)，在富集培養基上劃線(xiàn)分離出單菌落.
2.3.2 降解菌強化馴化、分離
挑取上述分離出的單菌落，50 mL含有一定濃度PCB77的滅菌MSM，裝入100 mL的三角瓶中，在30 ℃、150 r · min-1條件下振蕩培養，每5～7 d轉接1次，在相同條件下進(jìn)行傳代培養2個(gè)月，并不斷提高M(jìn)SM中的PCB77的濃度，馴化菌株對PCB77的降解能力.取馴化培養得到的菌懸液，在固體MSM上劃線(xiàn)分離純化，篩選出對PCB77有較高降解能力的菌株，將該降解菌株保存于試管斜面上，4 ℃冷藏保存.
2.3.3 降解菌鑒定及理化性質(zhì)測定
菌株測序委托上海生物工程有限公司完成，得到該細菌的16S rDNA序列.登陸Genbank，通過(guò)Blast數據庫進(jìn)行同源性比較，利用MEGA5.0軟件，選用鄰接法(Neighbor Joining)，繪制該細菌的系統發(fā)育樹(shù).參考《常見(jiàn)細菌系統鑒定手冊》、《伯杰氏系統細菌學(xué)手冊》和相關(guān)文獻進(jìn)行形態(tài)和生理生化鑒定.
2.3.4 菌株的生長(cháng)曲線(xiàn)測定
將純化后的菌株分別接種在液體富集培養基、含有1000 mg · L-1聯(lián)苯的MSM、含有1 mg · L-1 PCB77的MSM中，于30 ℃和150 r · min-1條件下培養，間隔一定時(shí)間取2 mL培養液，采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(UVmini-1240，SHIMADZU)測定其在600 nm處的吸光度值，以此來(lái)表征培養液中菌體濃度.
2.4 高效降解菌降解率影響因素實(shí)驗
2.4.1 菌液的制備
將馴化分離出的菌株接種于富集培養基中，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養至對數生長(cháng)期，以3500 r · min-1離心10 min，棄去上清液，用pH7.2的磷酸緩沖溶液洗滌沉淀物3次，重懸于相同培養基中，使最終OD600值約為1.0.
2.4.2 外加碳源對PCB77降解的影響
分別選取苯甲酸、鄰苯二甲酸、聯(lián)苯作為外加降解碳源.降解體系為裝有20 mL MSM的50 mL三角瓶，其中PCB77濃度為均1 mg · L-1.第1組為對照，第2組為1000 mg · L-1的聯(lián)苯，第3組為1000 mg · L-1的苯甲酸，第4組為1000 mg · L-1的鄰苯二甲酸.在30 ℃、150 r · min-1條件下培養7 d，取樣測定降解率.
2.4.3 體系pH對PCB77降解的影響
調節M(mǎn)SM的pH值，分別為3、4、5、6、6.5、7、7.5、8、9，接入2 mL(OD600=1.0)降解菌液，控制降解體系中PCB77濃度為1 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養7 d，取樣測定降解率.
2.4.4 PCB77初始濃度對降解的影響
在無(wú)菌條件下，準確移取一定量的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷揮發(fā)完全后，加入滅菌的MSM，并接入2 mL的菌懸液，使降解體系中PCB77的濃度分別為0、0.5、1.0、3.0、5.0 mg · L-1，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養7 d，取樣測定降解率.
2.4.5 微生物接種量對PCB77降解的影響
在無(wú)菌條件下，用移液槍分別移取0.5、1.0、2.0、4.0 mL菌懸液于MSM中，在30 ℃、150 r · min-1條件下培養7 d，取樣測定降解率，確定最適接種量.
2.4.6 重金屬對菌體降解PCB77的影響
用鉻和鉛作為外加重金屬，研究其對菌株降解PCB77的影響.在無(wú)菌條件下，準確移取2 mL濃度為10 mg · L-1的PCB77母液于50 mL三角瓶中，待正己烷揮發(fā)完全后，添加一定量的重金屬，并且接種菌液2 mL，使降解體系中重金屬濃度分別為0 mg · L-1、0.1 mg · L-1、1 mg · L-1、5mg · L-1、10 mg · L-1、20 mg · L-1，PCB77濃度均為1 mg · L-1.在30 ℃、150 r · min-1的搖床上培養7 d，取樣測定降解率.
以上降解率均指測定生長(cháng)細胞對PCB77的降解率，接種2 mL對數生長(cháng)期的菌懸液到20 mL不同降解體系中，測定7 d的降解率.每組實(shí)驗設定3組平行，并計算誤差.
2.4.7 PCB77的提取及測定方法
取20 mL正己烷加入降解體系中，超聲輔助萃取10 min(王炳玲，2014)，轉移混合液至分液漏斗中，待充分混合靜置分層后，將上下相分離，萃取3次.合并3次萃取得到的正己烷，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水處理后旋蒸至3～5 mL，氮吹近干，定容至5 mL，漩渦震蕩充分混合后，采用GC-MS測定，分析條件為30 m × 0.25 mm HP-5MS色譜柱，程序升溫，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL(史永富等，2014).
3 結果與討論
3.1 高效降解菌的生物學(xué)特性研究
3.1.1 菌株形態(tài)觀(guān)察
通過(guò)富集、馴化培養的方法，從長(cháng)期受有機污染的土壤中分離出1株多氯聯(lián)苯降解菌，該菌株能以PCB77為唯一碳源進(jìn)行生長(cháng)，并對PCB77具有較高的降解能力.
觀(guān)察可知，該菌株在無(wú)機鹽固體平板培養基上具有以下特點(diǎn)：細胞呈圓形，直徑約1 mm，不透明，菌落小，細胞表面光滑，邊緣規則，接種初期為淺黃色，培養后產(chǎn)生綠色分泌物.在液體篩選培養基上有以下特點(diǎn)：整個(gè)培養液呈渾濁狀，隨著(zhù)培養時(shí)間的增加，培養液顏色由透明的淡黃色，轉變成綠色并變渾濁，最后變成棕紅色.在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察，細胞形態(tài)呈短桿狀，經(jīng)革蘭氏染色，判斷為陰性菌.
3.1.2 菌株生理生化指標測定
對JXJ菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗，結果見(jiàn)表 1.
表1 菌株JXJ部分生理生化測定結果
3.1.3 多氯聯(lián)苯降解菌的鑒定
菌株的16S rDNA委托上海生工測定，獲得的測序結果利用GenBank中的Blast軟件進(jìn)行序列相似性比較，結果顯示菌株JXJ的16S rDNA序列與多種銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)具有高度相似性，相似度達99%.在GenBank數據庫中查找并下載與JXJ菌株基因有較高相似性菌種的16S rDNA片段，使用MEGA5.0軟件，繪制JXJ菌株的系統發(fā)育樹(shù).從圖 2可以初步判斷，JXJ屬于銅綠假單胞菌屬.
圖2 降解菌株JXJ的系統發(fā)育樹(shù)
3.2 不同培養條件對菌株JXJ生長(cháng)及降解PCB77的影響 3.2.1 菌株JXJ生長(cháng)曲線(xiàn)
菌株JXJ在不同培養基中的生長(cháng)情況如圖 3所示.從圖中可見(jiàn)，在相同培養條件下(30 ℃，150 r · min-1)，JXJ菌在富集培養基中長(cháng)勢最好，24 h達到對數生長(cháng)期，此后微生物量略有下降，并保持相對穩定.由于聯(lián)苯和PCB77都有一定生物毒性，在含有聯(lián)苯和PCB77的MSM中，JXJ菌在不利的環(huán)境條件下，調整期明顯延長(cháng)(栗冬梅等，2012).經(jīng)過(guò)約85 h后，JXJ菌快速生長(cháng)，生長(cháng)速率明顯上升.
圖3 不同培養基下菌株JXJ的生長(cháng)曲線(xiàn)
3.2.2 外加碳源對PCB77降解率的影響
考察JXJ菌在3種不同外加碳源條件下，對濃度為1 mg · L-1的PCB77降解率的影響.如圖 4所示，聯(lián)苯和鄰苯二甲酸的添加提高了JXJ菌對PCB77的降解率，而苯甲酸的加入對降解有一定的限制作用，其中聯(lián)苯對降解促進(jìn)作用最明顯，7 d降解率達到了58.5%，其次是鄰苯二甲酸，7 d降解率為53.8%，此時(shí)微生物利用外加的碳源，通過(guò)共代謝途徑，提高了降解效率(李方卉等，2014).苯甲酸的加入，對JXJ菌降解PCB77有一定的限制作用，可能與苯甲酸在水溶液中呈酸性，改變了體系pH條件，使得JXJ菌不能處于最佳生長(cháng)環(huán)境有關(guān).實(shí)驗結果運用單因素方差分析，在0.05的置信水平上，不同組間有顯著(zhù)差異，認為外加碳源的種類(lèi)對微生物降解PCB77有顯著(zhù)影響.
圖4 外加碳源對PCB77降解的影響
3.2.3 溫度、pH對PCB77降解率的影響
不同種類(lèi)的微生物，最適宜生長(cháng)的pH、溫度條件各不相同.培養體系pH的不同，會(huì )改變營(yíng)養物質(zhì)的生物可利用性和污染物的形態(tài)及生物毒性，從而影響微生物的活性，最終導致微生物生長(cháng)速率和污染物降解速率的變化(熊士昌等，2012).從圖 5a中可以看出，JXJ菌株可在pH值6.5~8范圍內較快的生長(cháng)，降解率保持在較高的水平，且在pH值為7.5時(shí)，7 d降解率高達49.3%，可見(jiàn)JXJ菌株適宜在中性或中性稍偏堿的條件下生長(cháng)，過(guò)酸和過(guò)堿的條件會(huì )對其降解效果產(chǎn)生副作用.
圖5 不同環(huán)境條件對PCB77降解的影響
微生物的生長(cháng)，需要一定的環(huán)境溫度條件.溫度相對較低時(shí)，隨著(zhù)溫度提升，微生物及其酶活性提高，降解率也隨之增大;超過(guò)微生物最適溫度后，溫度的升高會(huì )導致微生物活性下降，甚至死亡，PCB77的降解率呈現顯著(zhù)下降.由圖 5b可知，培養溫度對JXJ菌株降解PCB77具有較為顯著(zhù)的影響，菌株可在較寬泛的溫度區間降解PCB77，在25 ～ 40 ℃范圍內均能保持較好的降解能力，其中最適溫度為30 ℃.
3.2.4 PCB77
初始濃度對降解的影響 圖 6所示為不同初始底物濃度對PCB77降解的影響.可以看出，初始底物濃度較小時(shí)，JXJ菌對PCB77有較高的7 d降解效率;當底物濃度從1 mg · L-1升高到5 mg · L-1，相應的降解率從49.3%下降到16.8%.這是由于高濃度的底物對微生物活性產(chǎn)生了抑制作用，影響到了酶促反應的進(jìn)行，限制了微生物對污染物的降解(Cao et al., 2011).另一方面，當底物濃度從1 mg · L-1增加到2 mg · L-1時(shí)，降解量從9.86 μg提高到14.64 μg，因為低濃度時(shí)底物的生物毒性效應不明顯，且底物濃度的增大，可提高底物被微生物利用的幾率，從而提高降解量.繼續增大底物濃度，PCB77的7 d降解量基本保持不變，這是因為碳源的增加對生物代謝的促進(jìn)作用有限，且高濃度的底物對微生物活性有一定的限制作用.由此可以看出，微生物對PCB77有一定的降解能力，但通常較適用于低濃度污染，且降解過(guò)程較緩慢.
圖6 PCB77初始濃度對降解的影響
3.2.5 接種量對PCB77降解的影響
微生物的初始接種量能夠顯著(zhù)影響菌體生長(cháng).隨著(zhù)接菌量的增大，菌體可通過(guò)如種內協(xié)同作用，加快適應新環(huán)境，縮短調整期，利于菌體總量的增加，從而提高了微生物的降解效率.圖 7是接菌量對PCB77降解的影響，隨著(zhù)接菌量的增大，降解體系中PCB77的殘留率隨之減小;接菌量為0.5 mL時(shí)，PCB77的7 d殘留率為72.0%，是接菌量為4 mL時(shí)的1.67倍.
圖7 微生物接種量對PCB77降解的影響
3.2.6 外加重金屬對PCB77降解的影響
在添加鉛和鉻這兩種污染土壤中常見(jiàn)的重金屬后，JXJ菌對PCB77的7 d降解率出現了明顯差異，在相同濃度條件下，重金屬鉻對JXJ菌的抑制作用明顯強于鉛(圖 8).外加重金屬濃度較低時(shí)，鉻和鉛對JXJ菌限制較小，JXJ菌依然能保持較高的7 d降解率，鉛濃度為0.01 mg · L-1時(shí)，沒(méi)有明顯限制作用，當外加重金屬濃度逐漸增加，JXJ菌降解率有大幅度下降.在鉻濃度10 mg · L-1時(shí)的降解率約為0.01 mg · L-1時(shí)的一半;而同樣條件下，外加鉛時(shí)，降解率依然能夠保持在原來(lái)降解率的68%左右.這是因為不同重金屬離子對細菌生長(cháng)抑制的毒性大小可能與細胞壁的親和性有關(guān)，細菌細胞壁表面帶有的負電荷，對帶正電荷的金屬離子有親和作用，親和性越強對微生物毒性越大(王秀麗等，2003;Xu et al., 2014).由此可以看出，在不同重金屬存在時(shí)，其對JXJ菌的生長(cháng)以及對污染物降解的影響是不同的，并且高濃度的重金屬對JXJ菌均有一定的限制作用，因此JXJ菌適宜在污染物和重金屬濃度較低的情況下，可用來(lái)降解污染物.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖8 外加重金屬對PCB77降解的影響
4 結論
1)從長(cháng)期受有機物污染的土壤中馴化、篩選到1株能夠以PCB77為唯一碳源生長(cháng)的高效降解菌JXJ，革蘭氏染色鑒定為陰性菌，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為銅綠假單胞菌.
2)菌株JXJ在30 ℃，pH為7.5，微生物接種量為2 mL(OD600=1)菌液，PCB77初始濃度為1.0 mg · L-1時(shí)PCB77 7 d的降解率為49.6%.
3)在不同碳源條件下，菌株JXJ的降解能力不同，聯(lián)苯和鄰苯二甲酸為外加碳源時(shí)，對降解有促進(jìn)作用，且聯(lián)苯效果優(yōu)于鄰苯二甲酸;外加相同濃度苯甲酸時(shí)，對JXJ的降解有一定限制作用.
4)菌株JXJ可耐受一定濃度的重金屬，在低濃度外加重金屬鉻和鉛的條件下，依然能保持較高的降解率，具有一定的實(shí)際修復應用前景.在高濃度外加重金屬條件下，菌株生長(cháng)受到明顯抑制，降解率有大幅度下降，且鉻較鉛對菌株JXJ有更加明顯的抑制作用.
