污泥馴化過(guò)程中微生物群落變化

　　厭氧污泥是多種厭氧微生物形成的復雜聚集體，不同處理工藝內污泥中微生物群落的研究成為廢水處理反應器的研究熱點(diǎn). 反應器內微生物的群落結構的變化及生態(tài)演替受生態(tài)因子如溫度[1, 2]、 pH[2]、 氧化還原電位[3]、 反應器進(jìn)水成分[4]、 進(jìn)水碳硫比[5,6]等的影響; 同時(shí)，微生物種群的分布[10]、 不同微生物種群之間存在的協(xié)同[11]和競爭制約[12]生態(tài)學(xué)效應等，直接影響著(zhù)反應器的處理效果.

　　厭氧污泥的馴化是UASB 等厭氧反應器運行的關(guān)鍵，對厭氧污泥馴化過(guò)程中微生物生態(tài)結構的變化及群落演替的研究具有重要的意義. 近年來(lái)不依賴(lài)純培養的分子生物學(xué)的方法發(fā)展迅速，也得到廣泛的應用[13]，其中利用PCR-DGGE來(lái)研究未培養或不能培養的微生物，能夠提供群落中優(yōu)勢種類(lèi)信息和同時(shí)分析多個(gè)樣品，適合于監測或調查種群的時(shí)空變化，自從1993年被Muyzer等[14]引入微生物生態(tài)學(xué)研究以來(lái)，已廣泛應用于分析活性污泥[15]、 生物濾池[16]、 生物膜[17]、 土壤[18]、 底泥[19]、 水體[20]等各種環(huán)境中生物多樣性、 種群演替等方面. 本研究采用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技術(shù)，通過(guò)不依賴(lài)分離培養的核酸信息對處理高濃度硫酸鹽有機廢水UASB反應器污泥馴化過(guò)程中微生物群落的變化進(jìn)行了分析，以期為工藝優(yōu)化和揭示厭氧污泥中硫酸鹽生物處理機制提供科學(xué)依據.

　　1 材料與方法

　　1.1 硫酸鹽還原反應器污泥的馴化

　　采用UASB為硫酸鹽還原反應器，容積為19.4 L. 接種污泥來(lái)源于某污水處理廠(chǎng)ABR的厭氧污泥和河涌底泥的混合污泥，以人工配水進(jìn)行污泥馴化. 配水成分包含葡萄糖5 g ·L-1，酵母抽提物0.2 g ·L-1，Na2SO4 1.7 g ·L-1，MgSO4 0.03 g ·L-1，CaCl2 0.01 g ·L-1，KH2PO4 0.25 g ·L-1，NH4Cl 0.1 g ·L-1，NaHCO3 2 g ·L-1，(NH4)2CO3 0.1 g ·L-1，進(jìn)水pH約為7.0.

　　反應器污泥馴化采用固定進(jìn)水濃度，逐漸縮短水力停留時(shí)間的方法以提高反應器硫酸鹽負荷. 整個(gè)馴化過(guò)程歷時(shí)240 d，按水力停留時(shí)間的不同分為4個(gè)馴化階段，其中第0~150 d為第1階段，水力停留時(shí)間為80 h; 第150~180 d為第2階段，水力停留時(shí)間為60 h; 第180~210 d為第3階段，水力停留時(shí)間為48 h; 第210~240 d為第4階段，水力停留時(shí)間為24 h.

　　1.2 采樣

　　本研究共采集污泥樣品7個(gè)，自反應器污泥馴化的4個(gè)不同階段，分別于馴化開(kāi)始的第30、 60、 120、 150、 180、 210和240 d采用滅菌的離心管采集污泥樣品，樣品依次標記為A、 B、 C、 D、 E、 F和G. 所采集的樣品直接用于基因組DNA的提取或凍存-80℃冰箱中待用，并測定MLVSS. 此外，定期采集反應器進(jìn)出水水樣，測定其中COD和硫酸鹽含量的變化.

　　1.3 理化分析方法

　　MLVSS、 COD、 硫酸鹽采用文獻[21]的方法進(jìn)行測定.

　　1.4 變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析微生物群落變化 1.4.1 細菌基因組總DNA的提取與純化

　　取5 g污泥樣品，采用Zhou等[22]的方法進(jìn)行總DNA提取. 所得DNA初提液采用天根公司的DNA純化試劑盒進(jìn)行純化.

　　1.4.2 PCR擴增及變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

　　以純化后的細菌基因組總DNA為模板，采用細菌通用引物27F與1492R擴增以得到全長(cháng)16S rDNA; 再以該擴增產(chǎn)物為模板，采用對大多數細菌和古生菌的16S rDNA基因V3區具有特異性的引物對GC-341F和534R[23]進(jìn)行擴增.

　　PCR反應在MyCycler (Bio-Rad)上進(jìn)行，50 μL反應體系為50 ng的模板、 20 pmol正反向引物、 200 μmol ·L-1 dNTP、 5 μL的10×PCR buffer (不含MgCl2)、 1.5 mmol ·L-1的MgCl2、 1 U的ExTaq DNA聚合酶和適量的雙蒸水. 反應程序: 94℃ 4 min; 94℃ 45 s，55℃ 1 min，72℃ 45 s，30次循環(huán); 72℃ 10 min.

　　采用D-code基因突變檢測系統(Bio-Rad Laboratories Inc.USA)對 PCR 反應產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分離. 采用8%聚丙烯酰胺凝膠，變性劑范圍為35%~55%(100%的變性劑定義為7 mol ·L-1尿素和40%去離子甲酰胺)，在1×TAE(40 mmol ·L-1 Tris，20 mmol ·L-1乙酸，1 mmol ·L-1 EDTA，pH 7.4)中，60℃、150 V電泳6 h，用Goldenview染液染色，Bio-Rad凝膠成像系統觀(guān)察并拍照.

　　采用Quantity One軟件對DGGE圖譜進(jìn)行分析，對各泳道的條帶數目、 位置及亮度，不同樣品間細菌群落相似度用Dice系數計算，生成相似度矩陣.根據圖譜中不同條帶的光密度值,采用公式(1)和(2)計算微生物群落的Shannon-Wiener指數. �И�

　　��式中，ai為泳道中i條帶的光密度值，pi為i條帶光密度值占該泳道中所有條帶總光密度值的百分數，H為微生物群落的Shannon-Wiener指數.

　　采用SPSS軟件對馴化污泥化過(guò)程中反應器COD及硫酸鹽去除效率、 微生物群落Shannon-Wiener指數等參數的變化進(jìn)行相關(guān)性分析，選擇Pearson相關(guān)分析選項，軟件自動(dòng)完成.

　　1.4.3 切膠測序及系統發(fā)育分析

　　對DGGE圖譜上的優(yōu)勢條帶進(jìn)行切膠回收，以V3區引物(不帶GC夾)采用相同程序進(jìn)行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后采用PGM-T載體克隆至E.coli Top10后送交上海生物工程技術(shù)公司測序. 將測序結果提交NCBI數據庫Blast搜索出相似性高的序列，利用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，通過(guò)Mega 5構建系統發(fā)育樹(shù).

　　2 結果與討論

　　2.1 微生物群落多樣性及反應器處理效率變化

　　為考察厭氧污泥馴化過(guò)程中群落多樣性的變化情況，采集反應器馴化不同時(shí)期的污泥樣品，對其進(jìn)行微生物總DNA提取，并采用試劑盒對DNA初提液進(jìn)行純化，并以此為模板，采用巢式擴增，先用引物對27F/1492R 擴增得到污泥中微生物全長(cháng)16S rDNA，再以此為模板，采用引物對341/534擴增得到微生物16S rDNA V3可變區基因，通過(guò)變性梯度凝膠電泳(DGGE)進(jìn)行分析，不同泳道分別代表反應器馴化不同天數時(shí)所取反應器泥樣. 污泥馴化不同時(shí)期微生物群落變性梯度凝膠電泳圖譜分析如圖 1所示. 結果表明，重復電泳的結果非常相似，重復間的相似性達99%，7個(gè)不同時(shí)期的污泥樣品中微生物群落電泳圖譜中條帶的位置和數量不同，電泳條帶呈現較明顯的變化,顯示反應器污泥馴化的不同時(shí)期，隨著(zhù)反應器的污泥馴化，污泥樣品DGGE電泳圖譜中條帶數量增多，微生物群落結構和種群數量存在明顯的演替過(guò)程. 既有一些相同的微生物種群，如條帶1、 4、 7、 8、 9等，雖然亮度有所變化，但存在于整個(gè)馴化過(guò)程中; 也有一些種群(條帶)逐漸消亡或者減弱的,而一些種群(條帶)逐級出現或增強; 也有一些樣品各自獨有的種群，如第150 d樣品的條帶3; 另外還有相鄰階段共有的條帶，如第180 d和第210 d樣品的條帶13.

　　圖 1 污泥馴化不同階段的變性梯度凝膠電泳(DGGE)圖譜

　　采用凝膠分析軟件Quantity One 對反應器馴化不同時(shí)期污泥樣品電泳圖譜相似度進(jìn)行分析，分析結果見(jiàn)表 1. 結果顯示，反應器馴化相鄰階段時(shí)期，污泥中微生物群落相似度均在30%以上，其中樣品D與樣品E，以及樣品F與樣品G之間相似度均為57%左右，表明反應器馴化的第150~180 d、 第210~240 d這2個(gè)階段污泥中微生物群落變化較小. 而從不同時(shí)期反應器處理效率(圖 2)可知，恰好這2個(gè)階段是反應器硫酸鹽處理效率高效和穩定的時(shí)期，去除率達90%~99%.

　　表 1 反應器馴化不同時(shí)期污泥樣品DGGE圖譜相似度

　　為了解馴化過(guò)程中反應器處理效率與污泥中微生物群落多樣性指數變化的關(guān)系，采用SPSS軟件，對反應器馴化時(shí)間、 COD與硫酸鹽負荷及其去除效果、 污泥濃度、 污泥中微生物群落多樣性指數進(jìn)行相關(guān)性分析，結果見(jiàn)表 2.

　　結合圖 2和表 2來(lái)分析，可見(jiàn)反應器硫酸鹽及COD去除率與馴化時(shí)間、污泥濃度、污泥中微生物群落多樣性指數呈明顯的正相關(guān). 王愛(ài)杰等[24]在產(chǎn)酸脫硫反應器研究中發(fā)現，在不同的群落演替階段,每個(gè)種群的代謝活性有一定差別,表現為COD 去除率、 SO2-4去除率的差異. 而本研究中隨著(zhù)污泥馴化的進(jìn)行，微生物群落生物多樣性得以提高，當微生物群落Shannon指數大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時(shí)，硫酸鹽去除率穩定在95%左右，這說(shuō)明反應器污泥馴化成熟，處理系統中各菌群處于良好的協(xié)同狀態(tài).

　　圖 2 污泥馴化不同時(shí)期反應器處理效率及微生物群落多樣性變化的關(guān)系

　表 2 各參數相關(guān)性分析 1)

　　2.2 污泥中微生物系統發(fā)育分析

　　為了進(jìn)一步分析微生物群落結構中的優(yōu)勢菌株和污泥中微生物的系統發(fā)育,對電泳圖譜中較亮條帶進(jìn)行切割回收后，采用T載體克隆并測序進(jìn)行系統發(fā)育分析見(jiàn)圖 3.

　　圖 3 基于DGGE條帶16S rDNA序列的不同泥樣細菌系統發(fā)育樹(shù)

　　結合圖 1和圖 3可知，反應器污泥中微生物群落中主要包含4大類(lèi)群，其中Firmicutes占總數的50.0%,Proteobacteria占總數的28.6%，Deinococcus-Thermus占總數的14.3%,Chloroflexi占總數的7.1%.

　　污泥馴化過(guò)程中出現大量屬于Firmicutes的發(fā)酵產(chǎn)酸菌，如條帶1、4、7、8、9、10、14. 發(fā)酵產(chǎn)酸細菌能夠將大分子的底物(如蔗糖、 葡萄糖和果糖等)轉化為乙酸、乙醇、氫氣、甲醇和甲酸等易被SRB利用的物質(zhì);在為SRB提供底物,緩沖堿度變化,維持系統適合的代謝環(huán)境等方面起著(zhù)決定作用[24]. 本研究中的Firmicutes細菌均屬于梭菌屬Clostridium sp.，其中大部分菌群如條帶1、4、7、8、9所代表的菌群在反應器馴化的4個(gè)階段中均可監測到，為微生物群落中的優(yōu)勢菌屬. Clostridium嚴格厭氧，能夠產(chǎn)NH3H2S、H2,具有固氮、 發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)乙酸乳酸等功能[25]. Kaksonen等[26]在硫酸鹽還原反應器中曾分離得到Clostridium 菌株. 此外，任南琪等[27]在硫酸鹽還原反應器中也監測到Clostridium 的某些菌種隨硫酸鹽去除率的升高得以富集，在反應器中占優(yōu)勢. 有研究表明，隨著(zhù)不同種類(lèi)的Clostridium屬細菌的出現，其代謝產(chǎn)生大量發(fā)酵終產(chǎn)物作為硫酸鹽還原過(guò)程的作用底物，從而影響硫酸鹽還原菌群的豐度變化[28]，由此造成硫酸鹽還原菌群與Clostridia菌群呈平行的動(dòng)態(tài)變化[29]. 本研究中Clostridium細菌在所監測的微生物群落中所占百分數為50.0%，并且隨著(zhù)反應器硫酸鹽負荷的提高，屬于該屬的某些種類(lèi)細菌相繼出現或消亡，由此推測該屬菌群在本反應器的硫酸鹽還原過(guò)程中起著(zhù)重要的作用.

　　Chloroflexi 、Geobacter、Geopsychrobacter是廢水厭氧處理系統中的常見(jiàn)菌[30]，在本研究的污泥中也存在. 條帶3包含的序列屬于Chloroflexi，在反應器污泥馴化過(guò)程中(第150 d)曾成為優(yōu)勢菌群，但后來(lái)隨著(zhù)反應器污泥的進(jìn)一步馴化而消失. 顆粒污泥中經(jīng)常監測到Chloroflexi 細菌，Roest 等[31]認為污泥中的Chloroflexi細菌可能直接或間接參與丁酸鹽的降解. 條帶5包含的序列屬于變形菌門(mén)中的Geobacter sp.，自反應器馴化的第30 d后開(kāi)始成為反應器中的優(yōu)勢菌群之一，馴化至第150 d后，條帶亮度增強. Geobacter為厭氧菌，能夠氧化有機物為CO2，以鐵氧化物作為電子受體，被用于去除廢水中有機及金屬污染物[32]. 近年來(lái)在環(huán)境修復的研究中也發(fā)現該類(lèi)菌的存在[33]. 條帶12、 13包含的序列屬于Geopsychrobacter sp.,其中，條帶12在第60 d條亮度最強，在馴化的污泥過(guò)程中亮度減弱或消失，條帶13在污泥馴化的第150~210 d內占優(yōu)勢，該屬的某些細菌具有還原元素硫及Mn(Ⅳ),并氧化乙酸鹽、 琥珀酸鹽、 丙酸鹽的功能[34].

　　本研究在污泥馴化的第1及第2階段(第0~180 d)硫酸鹽還原菌屬均未占優(yōu)勢，但在馴化的最后2個(gè)階段(第210～240 d)監測到Desulfovibrio sp. (條帶11)占優(yōu)勢. Desulfovibrio sp.是革蘭氏陰性菌，為快速生長(cháng)的硫酸鹽還原菌，能夠部分氧化某些有機物為乙酸鹽和CO2 [35]，并利用氫為能源，以H+為電子受體，還原硫酸鹽為硫化物[36]. 本研究中僅監測到這一類(lèi)硫酸鹽還原菌群，是由于人工配水馴化，底物單一的原因. 此外，Desulfovibrio占優(yōu)勢的2個(gè)階段，反應器硫酸鹽去除效率最高，為95%以上，可見(jiàn)Desulfovibrio 的數量與硫酸鹽去除率間存在明顯的正相關(guān)，因此該菌屬的數量與活性是影響反應器硫酸鹽去除效率的重要因素. 這些結果與任南琪等[27]的研究結果一致.

　　此外，條帶2、 6所包含的序列屬于異常球菌-棲熱菌門(mén)(Deinococcus-Thermus)，它們在微生物生態(tài)系統中所起的作用尚不明確，還有待進(jìn)一步探索.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3 結論

　　(1) 反應器污泥馴化過(guò)程中，微生物群落生物多樣性與反應器硫酸鹽及COD去除率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系. 當微生物群落Shannon指數大于3.45、 污泥濃度大于40 g ·L-1時(shí)，硫酸鹽去除率穩定在95%左右，處理系統中各菌群處于良好的協(xié)同狀態(tài).

　　(2)反應器污泥中微生物群落主要包含Firmicutes、 Proteobacteria、Deinococcus-Thermus、Chloroflexi 4大類(lèi)群,分別占總數的50.0%、28.6%、 14.3%和7.1%. 隨著(zhù)反應器污泥的馴化，污泥的微生物群落結構和種群數量存在明顯的演替過(guò)程. 其中厭氧發(fā)酵細菌Clostridium sp.在馴化全過(guò)程中均占優(yōu)勢，但優(yōu)勢菌群的種類(lèi)發(fā)生變化; 厭氧細菌Chloroflexi sp.在反應器馴化污泥第150 d曾成為優(yōu)勢菌群，但后來(lái)隨著(zhù)反應器污泥的進(jìn)一步馴化而消失; 厭氧細菌Geobacter sp. 自反應器馴化的第30 d后開(kāi)始成為反應器中的優(yōu)勢菌群之一，馴化至第150 d后，成為優(yōu)勢菌群; 厭氧細菌Geopsychrobacter sp.在污泥馴化過(guò)程中相繼出現或消亡; Desulfovibrio sp.在污泥馴化的最后2個(gè)階段占優(yōu)勢.