焦化廢水是煤高溫干餾、煤氣凈化、副產(chǎn)品回收與精制過(guò)程中產(chǎn)生的一種有機廢水，可生化性差，其中的難降解有機污染物主要有酚類(lèi)化合物、氮雜環(huán)化合物和多環(huán)芳烴等.喹啉及其衍生物是焦化廢水中主要的多環(huán)芳香含氮雜環(huán)化合物，其毒性大，致畸性和致癌性作用強，因此，分離鑒定高效的喹啉降解菌對于生物法去除焦化廢水中喹啉及其衍生物具有廣泛的應用前景.
焦化廢水的處理主要包括脫酚、蒸氨、脫氰、除油、生化處理、混凝沉淀和高級氧化等過(guò)程，其中生化處理是焦化廢水處理的主體和核心.近年來(lái)，一些喹啉降解菌已從工業(yè)廢水污泥、煤和頁(yè)巖液化地等分離出來(lái)，如紅球菌 (Rhodococcus sp.)、從毛單胞菌 (Comamonas sp.)、脫硫桿菌 (Thiobacillus sp.)、皮氏伯克霍爾德菌 (Burkholderia pickettii)和假單胞菌 (Pseudomonas sp.)等. 1988年Holmes等首次報道鑒定了Ochrobactrum anthropi，現有的研究表明Ochrobactrum sp.能降解苯酚及菲、芘和熒蒽等多環(huán)芳烴，此外，還具有Cr和Pb及As等重金屬耐性，且能將Cr (Ⅵ) 還原為Cr (Ⅲ).另外，在焦化廢水反硝化生物反應器中分離鑒定的2株Ochrobactrum sp.具有降解喹啉的作用，但其喹啉降解特性和生物強化作用的研究尚未見(jiàn)報道.
焦化廢水中含有Cu、Hg、Cr和Zn等重金屬污染物，喹啉降解菌在Cr (Ⅵ) 存在下的降解作用未見(jiàn)報道，研究重金屬離子存在下細菌對喹啉的降解作用對于處理含有重金屬和有機污染物的工業(yè)廢水具有重要意義.本文以某焦化廠(chǎng)的活性污泥為菌源，以喹啉為唯一碳氮源和能源分離鑒定喹啉降解菌，研究其好氧降解特性，并考察其在實(shí)際焦化廢水中的喹啉去除作用，以期為焦化廢水和重金屬-有機物復合污染廢水的生物處理提供理論依據與菌源.
1 材料與方法1.1 培養基
牛肉膏蛋白胨培養基，用于喹啉降解菌的富集培養和鑒定.
無(wú)機鹽培養基 (MSM)[6]，每升溶液中含有Na2HPO4 4.26 g，KH2PO4 2.65 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，CaCl2 0.006 g和微量元素溶液 (Na2MoO4·2H2O 0.12 g·L-1，CaCl2·2H2O 2 g·L-1，MnSO4·H2O 0.2 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.1 g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.2 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.09 g·L-1，H3BO3 0.006 g·L-1)1 mL，pH為7.0.
1.2 菌株的富集、分離與鑒定
取某焦化廠(chǎng)好氧池活性污泥20 mL，接入含有100 mL富集培養基的三角瓶中，在37℃、150 r·min-1轉速條件下培養1 d，沉淀10 min后，取2 mL上清液轉接到含200 mg·L-1喹啉的無(wú)機鹽培養基中培養2~3 d，按照5%的接種量轉接到含300 mg·L-1喹啉的無(wú)機鹽培養基中培養，逐步提高喹啉濃度，馴化培養喹啉降解菌.將馴化培養的菌液稀釋均勻涂在含200 mg·L-1喹啉的無(wú)機鹽平板培養基上，在37℃生化培養箱中培養3~4 d，挑取單個(gè)菌落純化培養，進(jìn)行菌株鑒定以及喹啉降解特性研究.
菌種鑒定用形態(tài)觀(guān)察和16S rDNA序列分析方法.形態(tài)觀(guān)察用透射電子顯微鏡 (JEM-1400，日本電子JEDL) 觀(guān)察. 16S rDNA序列擴增用通用引物：27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，在NCBI數據庫用BLAST程序比對分析.
1.3 環(huán)境條件對菌株喹啉降解的影響
將菌株接至含有200 mg·L-1喹啉的牛肉膏蛋白胨培養基中震蕩培養 (37℃、150 r·min-1) 至對數期，在4℃下12000 r·min-1離心10 min收集菌體，無(wú)菌水洗滌2次，用無(wú)機鹽培養基將菌株生物量 (D600) 調至1.5，得到活化的種子菌懸液.將活化的菌懸液以5%接種量接入含300 mg·L-1喹啉的無(wú)機鹽培養基中，分別在不同溫度 (23、28、32、37和42℃) 下振蕩培養，24 h時(shí)取樣測定菌株生物量及剩余喹啉濃度，確定最適降解溫度.在最適溫度下，24 h時(shí)測定不同初始pH值 (4、5、6、7、8、9、10和11) 條件下菌株的生物量和剩余喹啉濃度，確定最適生長(cháng)和喹啉降解pH.在最佳培養條件下，測定不同初始喹啉濃度 (30、60、100、150、200、250、300、400、500和600 mg·L-1) 對菌株生長(cháng)和喹啉降解速率的影響;根據喹啉濃度和生物量隨時(shí)間的變化關(guān)系計算比降解速率，用Matlab軟件按照底物抑制型Haldane方程進(jìn)行擬合.
在200 mg·L-1喹啉的無(wú)機鹽培養基中加入K2Cr2O7，使Cr (Ⅵ) 濃度分別為2.6、5.2、7.8和10.4 mg·L-1，在37℃下、150 r·min-1振蕩培養，定時(shí)取樣，測定菌株的生物量和剩余喹啉濃度.
1.4 菌株對實(shí)際焦化廢水中喹啉的降解作用
將取自某焦化廢水處理廠(chǎng)的曝氣池進(jìn)水 (CW) 用雙層濾膜過(guò)濾后，用二沉池污泥 (S) 將MLSS調至約4%，將活化的菌懸液以5%接種量接入含有150 mL焦化廢水中的三角瓶中，在37℃下進(jìn)行搖瓶實(shí)驗，分析焦化廢水中的喹啉、苯酚和COD的去除率.
1.5 分析方法
細菌生物量用可見(jiàn)光分光光度計在600 nm下測定的光密度 (D600) 表示，喹啉濃度用紫外光分光光度計在313 nm波長(cháng)下測定，苯酚濃度測定用4-氨基安替比林法. COD濃度測定用快速消解分光光度法.
2 結果與討論2.1 KDQ3菌株的分離和鑒定
某焦化廢水處理廠(chǎng)活性污泥中的微生物菌群經(jīng)富集、分離和馴化后，得到1株喹啉降解菌，命名為KDQ3，其在24 h內可將300 mg·L-1喹啉降解93.6%.在牛肉膏平板培養基上，KDQ3菌落為圓形，邊緣光滑圓潤，淡黃色，質(zhì)地濕潤.透射電子顯微鏡表明KDQ3菌為桿菌，有鞭毛 (圖 1). BLAST比較分析顯示KDQ3菌株與NCBI數據庫中的Ochrobactrum sp.的同源性達到98%，表明該菌屬于Ochrobactrum sp.(GenBank注冊號：KY681806).
圖 1 KDQ3菌株的透射電子顯微鏡圖
2.2 環(huán)境因素對KDQ3菌株生長(cháng)和喹啉降解的影響
溫度影響細胞膜的流動(dòng)性和物質(zhì)的溶解，也影響細胞生長(cháng)和酶促反應速率. 圖 2結果表明在23℃下，KDQ3的生物量D600和喹啉降解率 (24 h) 分別為0.15和12.4%，D600和喹啉降解率隨溫度升高而增大，37℃時(shí)均達到最大值;然后，其又隨著(zhù)溫度的繼續升高而急劇下降，當溫度達到42℃時(shí)，D600幾乎沒(méi)有增加，KDQ3死亡，喹啉也沒(méi)有降解.說(shuō)明在23℃下細菌生長(cháng)緩慢，喹啉降解能力減弱;而在42℃下，可能是由于高溫引起蛋白質(zhì)變性，致使細菌死亡，喹啉降解能力喪失.從焦化廢水活性污泥中分離的Acidovorax sp. DQS-01的最適溫度為35℃，Rhodococcus sp. QL2最適溫度為37℃，而Pseudomonas sp. BW003和BW004均為30℃.因此，在實(shí)際污水處理中，好氧池的溫度應保持在30~37℃，以提高菌株的喹啉降解效率.
圖 2 溫度和pH對KDQ3菌株生長(cháng)和喹啉降解的影響
pH影響微生物對營(yíng)養物質(zhì)的吸收和代謝過(guò)程. 圖 2結果表明D600與喹啉降解率成正相關(guān)，在初始pH 7~8時(shí)，KDQ3菌株生長(cháng)最快，生物活性最高，24 h時(shí)喹啉的降解率高達91.8%，說(shuō)明KDQ3降解喹啉的最適初始pH為7~8. Acidovorax sp. DQS-01降解喹啉的最適pH為8~10，Rhodococcus sp. QL2的最適pH為8~9，Pseudomonas putida WS-5降解喹啉的最適pH為9，而Pseudomonas sp. BW003和BW004的最適pH為7~8.說(shuō)明喹啉降解菌的最適pH為7~10，堿性環(huán)境可中和喹啉降解產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物，促進(jìn)微生物的代謝過(guò)程，增強微生物對喹啉的降解利用.同時(shí)，焦化廢水中存在大量的氨氮，蒸氨后廢水的pH約8~9，呈弱堿性，所以KDQ3可用于強化焦化廢水的生物處理過(guò)程.
2.3 KDQ3降解動(dòng)力學(xué)
在最佳的溫度和pH條件下，分析KDQ3降解喹啉的動(dòng)力學(xué). 圖 3結果表明在23.73~492.27 mg·L-1喹啉濃度范圍內，初始喹啉濃度越高，KDQ3生長(cháng)的適應期越長(cháng)，喹啉對菌株生長(cháng)的抑制作用越大，喹啉完全降解需要的時(shí)間也越長(cháng);當喹啉濃度達579.29 mg·L-1時(shí)，KDQ3的D600在48 h內不增反降，喹啉濃度降低甚微，表明高濃度喹啉具有抑制KDQ3生長(cháng)和喹啉降解的作用.
圖 3 不同喹啉濃度對KDQ3菌株生物量和喹啉降解率的影響
根據KDQ3降解喹啉的比降解速率與底物濃度的實(shí)驗數據，通過(guò)Matlab軟件按照Haldane方程對比降解速率進(jìn)行非線(xiàn)性最小二乘曲線(xiàn)擬合，擬合的喹啉降解動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)和實(shí)驗數據結果如圖 4，得出KDQ3降解喹啉的動(dòng)力學(xué)參數為：qmax=0.18 h-1、Ks=16. 6 mg·L-1和Ki=241.7 mg·L-1. Ks為半飽和常數，Ki為抑制系數，Ki值越高，底物對微生物毒性越低，而微生物對底物的耐受性越高. Acidovorax sp. DQS-01降解喹啉的動(dòng)力學(xué)參數為qmax=0.64 h-1、Ks=164 mg·L-1和Ki=253 mg·L-1, Rhodococcus sp. QL2降解喹啉的動(dòng)力學(xué)參數為qmax=0.49 h-1、Ks=68.7 mg·L-1和Ki=387.1 mg·L-1[6]，Burkholderia pickettii降解喹啉的動(dòng)力學(xué)參數為qmax=0.44 h-1、Ks=166.7 mg·L-1和Ki=650 mg·L-1;與之相比，KDQ3的最大比降解速率 (0.18 h-1) 和抑制系數 (241.7 mg·L-1) 均較小，然而，在好氧池中喹啉濃度一般在50~150 mg·L-1，遠低于抑制系數Ki，所以，KDQ3作為活性污泥微生物菌群中的一員可能在降解喹啉過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.
圖 4 實(shí)驗數據與回歸曲線(xiàn)
2.4 KDQ3在Cr (Ⅵ) 存在時(shí)的喹啉降解作用
焦化廢水中含有重金屬Cr污染物，在2.6、5.2、7.8或10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 濃度下，以200 mg·L-1喹啉為唯一碳氮源，分析Cr (Ⅵ) 對喹啉的降解作用.結果表明在接種48 h內，KDQ3的生物量隨時(shí)間的增加而增加，喹啉降解率的變化趨勢與生物量一致 (圖 5);48 h時(shí)KDQ3的生物量達到最大值 (0.26~0.31)，喹啉降解率也達到最大值 (88.1%~92.7%)，表明喹啉的降解是由于KDQ3的生長(cháng)所致.在細菌的快速生長(cháng)階段 (16~48 h)，KDQ3的生物量隨著(zhù)Cr (Ⅵ) 濃度升高而降低，24 h差異較大;同樣，喹啉降解率也隨著(zhù)Cr (Ⅵ) 濃度升高而降低，24 h差異較大，表明Cr (Ⅵ) 具有抑制KDQ3生長(cháng)和喹啉降解的作用.雖然10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 對KDQ3生長(cháng)具有一定的抑制作用，但在其穩定生長(cháng)期，喹啉的降解率也能達到88.1%，表明KDQ3在2.6~10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 存在下能有效地降解喹啉.水體中的Cr (Ⅵ) 多溶于水中，而Cr (Ⅲ) 可吸附在固體物質(zhì)上而存在于沉積物 (底泥) 中，Cr (Ⅵ) 對微生物的毒性遠高于Cr (Ⅲ).皮革廠(chǎng)污水是重金屬和有機物復合污染廢水，Sultan等從皮革廠(chǎng)污水中分離的Ochrobactrum intermedium STCr-5能高效還原100~1 000 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，在72 h內其能完全還原200 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，96 h對1000 mg·L-1Cr (Ⅵ) 的還原率為50%.從制革廢水中分離的Ochrobactrum intermedium CrT-1在24 h對100、500和1 000 mg·L-1的Cr (Ⅵ) 的還原率分別達82%、28%和16%[29].從鉻污染填埋場(chǎng)分離的Ochrobactrum sp. CSCr-3能高效還原100~800 mg·L-1的Cr (Ⅵ)，在30 h內能將282.7 mg·L-1的Cr (Ⅵ) 還原90%，表明Ochrobactrum sp.具有較高的Cr (Ⅵ) 耐受和還原能力.同時(shí)，由于Ochrobactrum sp.具有廣譜的有機物利用范圍，可降解苯酚、菲、芘、熒蒽、甲基對硫磷和硝基酚等多種難降解有機物[12~14].本研究首次報道KDQ3具有在Cr (Ⅵ) 存在下的降解喹啉能力.所以Ochrobactrum sp.可能在制革和焦化企業(yè)產(chǎn)生的重金屬-有機物復合污染的工業(yè)廢水處理領(lǐng)域擁有潛在的應用前景.
圖 5 Cr (Ⅵ) 濃度對KDQ3生長(cháng)和喹啉降解的影響
2.5 KDQ3在實(shí)際焦化廢水中的降解作用
某焦化廢水處理廠(chǎng)曝氣池進(jìn)水的COD為650~750 mg·L-1、苯酚為50~150 mg·L-1和喹啉為80~120 mg·L-1，pH 7~8. 圖 6結果表明在未接種的對照焦化廢水 (CW+S) 中，喹啉濃度在12~24 h有上升趨勢，而在接種KDQ3的焦化廢水 (CW+S+KDQ3) 中，喹啉濃度在18 h開(kāi)始下降，24 h時(shí)喹啉降解率達23.3%.活性污泥中含有苯酚降解菌，對照和接種焦化廢水中的苯酚均在12 h內迅速降解，然后穩定在71 mg·L-1. COD分析表明在16 h內對照與接種焦化廢水的COD均呈下降趨勢，對照和接種的COD去除率 (分別為20.7%和25.9%) 相似，這可能是由于苯酚降解導致COD降低所致;16 h后苯酚不再降解，對照的COD也停止下降，而接種的COD由于喹啉的開(kāi)始降解而降低;在24 h時(shí)接種的COD去除率達到31.4%，高于對照的COD去除率 (20.9%).表明KDQ3能在含有高濃度酚類(lèi)和難降解有機物的焦化廢水中降解喹啉，且能與污泥中微生物協(xié)同作用降低COD，表明KDQ3具有生物強化處理焦化廢水的潛力.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖 6 KDQ3對焦化廢水中喹啉、苯酚和COD的去除
3 結論
(1) 經(jīng)富集馴化培養從某焦化廢水處理廠(chǎng)好氧池污泥中篩選出1株喹啉降解菌Ochrobactrum sp. KDQ3，其降解喹啉的最適條件為37℃和pH 7.0~8.0;喹啉降解動(dòng)力學(xué)符合Haldane方程，動(dòng)力學(xué)參數為：qmax=0.179 h-1、Ks=16. 6 mg·L-1和Ki=241.7 mg·L-1.
(2) KDQ3能在10.4 mg·L-1 Cr (Ⅵ) 存在下降解200 mg·L-1喹啉，并能在實(shí)際焦化廢水中降解喹啉和去除COD，所以，KDQ3具有焦化廢水生物強化的應用潛力.
