由于社會(huì )經(jīng)濟發(fā)展迅速,各種類(lèi)型的污染產(chǎn)生的復合效應加劇了我國水環(huán)境生態(tài)的風(fēng)險。在我國城市化程度較高的地區,從飲用水和污水中都檢測出不同類(lèi)型的新興污染物,如持久性有機物、內分泌干擾物、抗生素等。在污水尚未得到有效處理的情況下,水源很容易受到污染,使飲用水的安全供應面臨巨大挑戰;因此,研究新興污染物對污水處理系統的影響,將為新形勢下污水的有效處理提供指導。
四環(huán)素是一類(lèi)水體中常見(jiàn)的廣譜抗生素 ,它能與核蛋白體的30S 亞單位結合,阻止氨�；鵷RNA 同核蛋白體結合,抑制蛋白質(zhì)的合成。同時(shí),四環(huán)素類(lèi)藥物的廣泛使用引起了四環(huán)素耐藥細菌在環(huán)境中產(chǎn)生并快速傳播。至今,被發(fā)現的四環(huán)素耐藥細菌有115 屬、530 種(抗生素抗性基因數據庫http:∥ardb. cbcb. umd. edu/ )。不同來(lái)源廢水中四環(huán)素的含量差異較大,一般含量在幾十ng·L - 1 到幾百μg·L - 1 之間。近年來(lái),四環(huán)素對污水處理系統的影響引起了廣泛關(guān)注。CETECIOGLU 等 在SBR 中通過(guò)測定COD 的含量和氣體的產(chǎn)量的變化發(fā)現,當四環(huán)素投加量低于8. 5 mg·L - 1 時(shí),反應器內底物降解作用不受影響,但產(chǎn)氣量減小了10% ~ 20% ,說(shuō)明四環(huán)素對系統中微生物造成了影響。AYDIN 等在A(yíng)SBR中通過(guò)測定甲烷產(chǎn)量和揮發(fā)性脂肪酸的積累量的變化發(fā)現,不同濃度組合的四環(huán)素、紅霉素和磺胺對同型乙酸菌和產(chǎn)甲烷菌產(chǎn)生了不同程度的影響。AYDIN 等 在隨后的研究中又分別運用了real-time PCR 和PCR-DGGE 分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)現,四環(huán)素、紅霉素、磺胺3 種抗生素共同影響下產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷古菌存在互營(yíng)關(guān)系且這種互營(yíng)關(guān)系對反應器的穩定運行起關(guān)鍵作用。
隨著(zhù)分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,高通量測序技術(shù)已被廣泛使用在研究土壤、海洋、污水、活性污泥的群落結構中。第2 代Illumina MiSeq 高通量測序能克服傳統檢測方法的缺陷,具有通量高、錯誤率低、成本低、流程自動(dòng)化、速度快等優(yōu)勢 ,目前已在研究微生物多樣性群落結構方面受到廣泛認可 ;因此,將Illumina MiSeq 高通量測序方法應用于污水處理系統的研究,對深入認識污水處理系統具有實(shí)際意義。
當前,污水厭氧處理因其高效能、低能耗等特點(diǎn)在污水處理工程上開(kāi)始受到關(guān)注。它實(shí)際上是借助于不同微生物種群間的協(xié)同作用,通過(guò)水解—酸化(產(chǎn)氫及產(chǎn)乙酸)—產(chǎn)甲烷等一系列生物反應將有機底物轉化為甲烷和無(wú)機物的過(guò)程。在這個(gè)過(guò)程中,微生物群落構成直接影響到污水處理的效果,因此,深入認識污水厭氧消化系統的微生物群落構成,對厭氧污水處理系統的穩定運行具有指導作用。
基于此,本研究通過(guò)室內模擬實(shí)驗,選擇ABR 多相厭氧反應器進(jìn)行連續流實(shí)驗,啟動(dòng)反應器達到穩定狀態(tài)后,分別在不含四環(huán)素和含有250 μg·L - 1 四環(huán)素的人工配制污水條件下運行90 d,通過(guò)考察來(lái)自反應器的氫氣、甲烷產(chǎn)生量的變化,運用Illumina MiSeq 高通量測序方法對反應器中的微生物群落構成進(jìn)行分析,研究四環(huán)素對污水厭氧處理系統微生物群落造成的影響,以期從微生物關(guān)系角度深入了解這種影響,為污水厭氧處理技術(shù)研究及工程實(shí)踐提供參考。
1 材料和方法
1. 1 實(shí)驗裝置
ABR 采用厚為5 mm 的有機玻璃板加工制成,尺寸為455 mm × 150 mm × 400 mm,有效容積為21L,置于(35 ± 1)℃ 的恒溫箱中。反應器分為3 個(gè)格室,按照前后順序分為格室1、格室2、格室3,分別命名為C1、C2、C3,每個(gè)格室由上、下流室(體積比為3 ∶ 1) 組成, 折流板底角為45°。格室體積比V1 ∶ V2 ∶ V3 = 1. 5 ∶ 1 ∶ 1。每個(gè)格室上部設有集氣口,側部分別設有取水口、取泥口,實(shí)驗裝置見(jiàn)圖1。
1. 2 接種污泥
接種污泥取自廣州市瀝窖污水處理廠(chǎng)A2 / O 工藝的厭氧池。污泥MLSS = 24. 67 g·L - 1 ,MLVSS/MLSS = 0. 61,pH = 6. 58,含水率為97. 30% 。接種污泥體積為反應器有效容積的1 /3。
1. 3 實(shí)驗用水
配水以葡萄糖為碳源,NH4 Cl 和KH2 PO4 分別為氮源和磷源,同時(shí)加入Ca、Mg、Fe、Co、Ni 等微量元素,以保證微生物細胞合成的需要。此外,向配水中投加一定量的NaHCO3 以保證ABR 內的緩沖能力。
反應器以連續流方式進(jìn)水,水力停留時(shí)間(HRT)為24 h。在啟動(dòng)階段,采用逐步增加進(jìn)水負荷的啟動(dòng)方式,進(jìn)水COD 濃度為500 ~ 2 000 mg·L - 1 ,當COD 去除率穩定在80% 以上、出水各項指標(pH、堿度、VFA)趨于正常,啟動(dòng)階段完成。反應器的運行先后經(jīng)歷了啟動(dòng)階段(56 d)、穩定運行階段(90 d)、添加四環(huán)素(250 μg·L - 1 )運行階段(90 d)。
1. 4 DNA 的提取和PCR 擴增及其微生物多樣性數據分析
分別在反應器的穩定運行階段和添加四環(huán)素運行階段每間隔18 d 從每個(gè)格室采集一次活性污泥樣本,分別命名為Ctrl D18C1、Ctrl D36C1、Ctrl D54C1、Ctrl D72C1、Ctrl D90C1、Tre D18C1、Tre D36C1、TreD54C1、Tre D72C1、Tre D90C1,其中“Ctrl”代表未添加四環(huán)素運行時(shí)的污泥樣本,“Tre”代表添加四環(huán)素運行時(shí)的污泥樣本,“D18”代表第18 天取樣,“C1”代表樣本取自格室1,格室2 和格室3 的樣本命名為C2和C3。實(shí)驗共從3 個(gè)格室中共采集到30 個(gè)活性污泥樣本。分別稱(chēng)取0. 4 g 污泥用于DNA 提取。采用MOBIO PowerSoil DNA Isolation Kit DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取,提取步驟依據說(shuō)明書(shū)操作,提取好的DNA 保存于- 20 ℃ 冰箱。
以提取的基因組DNA 作為模板,使用16S rRNA 基因V4 區特異性引物F515 和R806 進(jìn)行PCR 擴增,擴增片段長(cháng)度約為300 bp。本實(shí)驗采用50 μL 的PCR 反應體系:1 μL 模板,各1 μL 的10 μmol·L - 1正向引物和反向引物(華大),0. 2 μL 20 mg·mL - 1 的蛋白質(zhì)(TaKaRa),25 μL 的Premix Ex Taq Version(Ex Taq Version 2. 0 plus dye)(TaKaRa),21. 8 μL 滅菌水(TaKaRa)。PCR 的反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 45 s,31 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。將各樣品的PCR 產(chǎn)物按照等摩爾量進(jìn)行混合,使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen,Chatsworth,CA,USA)凝膠回收試劑盒切膠回收PCR 混合產(chǎn)物,并用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測,最后使用Illumina MiSeq 高通量測序平臺進(jìn)行基因測序。
測序結束后,首先,使用Trimmomatic (Version 0. 33)軟件去掉序列3′端連續的低質(zhì)量堿基。接著(zhù),用Mothur (Version 1. 35. 1)中的“make. contigs”命令將兩端reads 拼接成完整的目的DNA 片段,再用“screen. seqs”,“trim. seqs” 命令進(jìn)行錯誤序列的識別和修剪。最后,使用QIIME 軟件對測序數據進(jìn)行微生物的多樣性分析,將得到的序列進(jìn)行聚類(lèi),將97% 相似性的序列聚類(lèi)成為OTUs (operational taxonomic units)。物種分類(lèi)由UCLUST (Version 1. 2. 22)軟件 和Greengenes OTU 數據庫(gg_13_8_otus) 實(shí)現。
1. 5 反應器氣體產(chǎn)生的分析
于固定時(shí)間每6 d 測定一次格室內產(chǎn)生氣體中氫氣和甲烷的含量,檢測方法為氣相色譜法。使用儀器為安捷倫7820A 氣相色譜儀,檢測器為T(mén)CD,色譜柱為T(mén)DX-01,色譜條件如下:進(jìn)樣口、色譜柱、檢測器的溫度分別為100、100 和200 ℃ ;載氣為氮氣,流量為35 mL·min - 1 ;進(jìn)樣量為1 mL。
2 結果和分析
2. 1 四環(huán)素對反應器內氣體產(chǎn)生的影響
ABR 3 個(gè)格室中氫氣的產(chǎn)生情況如圖2 所示。僅在格室1 中檢測到氫氣的存在,而格室2 和格室3中沒(méi)有檢測到氫氣的產(chǎn)生,這主要是由于格室1 進(jìn)行的是產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸反應,而后端格室主要進(jìn)行的是產(chǎn)甲烷反應。未添加四環(huán)素運行時(shí),格室1 內氫氣的平均產(chǎn)量為0. 010 2 L·(g·d) - 1 (以MLSS 計)。添加四環(huán)素后,氫氣產(chǎn)量是未添加四環(huán)素時(shí)氫氣產(chǎn)量平均值的4. 05 ~ 6. 89 倍。說(shuō)明四環(huán)素的添加能使氫氣產(chǎn)量增加。
ABR 3 個(gè)格室甲烷產(chǎn)生情況,如圖3 所示。在未添加四環(huán)素時(shí),格室1、格室2、格室3 的甲烷平均產(chǎn)量分別為0. 320 4、0. 146 2、0. 088 1 L·(g·d) - 1(以MLSS 計)。顯然,甲烷產(chǎn)量在縱向上呈降低的趨勢。這與反應器內的底物分配有關(guān),格室1 進(jìn)水有機物含量較高,隨著(zhù)格室內微生物的降解作用,有機物含量在縱向上隨著(zhù)格室逐漸降低,有機物的減少使得甲烷產(chǎn)量在格室間縱向減小。添加四環(huán)素后,格室1、格室2、格室3 的甲烷產(chǎn)量隨著(zhù)運行時(shí)間的推移呈現不同程度的下降,分別是未添加四環(huán)素時(shí)對應甲烷平均產(chǎn)量的43. 90% ~ 80. 20% 、27. 18%~ 79. 79% 、38. 24% ~ 83. 70% 。通過(guò)對比四環(huán)素添加后同一個(gè)格室不同時(shí)間的甲烷產(chǎn)量變化,發(fā)現甲烷產(chǎn)量隨著(zhù)運行時(shí)間的推移呈現下降趨勢,說(shuō)明四環(huán)素對產(chǎn)甲烷的抑制作用隨著(zhù)時(shí)間的推移增大。
2. 2 微生物豐度分析
通過(guò)反應器中獲取的DNA 序列與GreengenesOTU 數據庫進(jìn)行比對,得出反應器中微生物主要有16 個(gè)屬,如圖4 所示。分別為甲烷桿菌屬( Methanobacterium)、密螺旋體屬(Treponema)、寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、長(cháng)繩菌屬( Longilinea)、叢毛單胞菌屬( Comamonas )、互營(yíng)桿菌屬( Syntrophobacter)、梭菌屬(Clostridium)、浮霉狀菌屬(Planctomyces)、Blvii28、Paludibacter、AUTHM297、WCHB1-05、A17、W22。
由圖4 可知,隨著(zhù)四環(huán)素的添加,不同物種呈現出不同的變化趨勢。其中,隨著(zhù)四環(huán)素的添加,密螺旋體屬(Treponema)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)、W22 的豐度在3 個(gè)格室內均呈現增長(cháng)的趨勢,說(shuō)明密螺旋體屬(Treponema)、互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、W22 對四環(huán)素具有一定耐藥性。
密螺旋體屬(Treponema)能利用氫氣和二氧化碳轉化成乙酸。添加四環(huán)素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內的密螺旋體屬(Treponema)分別是未添加四環(huán)素時(shí)相應密螺旋體屬(Treponema)平均豐度的1. 09 ~ 2. 00 倍、1. 27 ~ 1. 79 倍、1. 41 ~ 6. 52 倍,密螺旋體屬(Treponema)豐度的增加說(shuō)明四環(huán)素的添加能促進(jìn)氫氣和二氧化碳轉化成乙酸的過(guò)程,有利于乙酸的積累。有研究表明,乙酸是微生物燃料電池生產(chǎn)電能的首選底物,1 t 生物質(zhì)可產(chǎn)出價(jià)值150 美元的乙酸,卻只能產(chǎn)出31 美元的甲烷;因此,在處理四環(huán)素污水時(shí),可以充分利用密螺旋體屬(Treponema)的優(yōu)勢,增加乙酸積累,可以通過(guò)耦合系統將乙酸轉化為微生物燃料電池能源或作為發(fā)酵工業(yè)的原料,實(shí)現資源回收。
互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)是一類(lèi)產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌,能將高級脂肪酸和醇類(lèi)氧化分解為乙酸和H2 。
添加四環(huán)素后,如表1 所示,除了格室1 第18 天和格室3 第54 天的互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)比未添加四環(huán)素時(shí)平均豐度低,這可能是由于反應器運行過(guò)程中其他條件擾動(dòng)引起的,其他時(shí)間內格室1、格室2、格室3 內的互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)分別是未添加四環(huán)素時(shí)相應互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)平均豐度的1. 37 ~ 2. 04 倍、1. 00 ~ 3. 95 倍、1. 48 ~ 2. 98 倍,互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)豐度的增加說(shuō)明四環(huán)素的添加有利于產(chǎn)氫過(guò)程,與2. 1 中氫氣產(chǎn)量增大的結論相印證。氫氣是一種清潔能源,具有燃燒熱值高、燃燒產(chǎn)物無(wú)污染的特點(diǎn),具有很好的應用價(jià)值;因此,在處理四環(huán)素污水時(shí),可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本。
脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)是一類(lèi)硫酸鹽還原菌,它能利用金屬表面的有機物作為碳源,將硫酸鹽還原成硫化氫,加速金屬管材的腐蝕。添加四環(huán)素后,如表1 所示,格室1、格室2、格室3 內的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)分別是未添加四環(huán)素時(shí)相應脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)平均豐度的1. 09 ~ 3. 99 倍、1. 12 ~3. 59 倍、1. 20 ~ 7. 40 倍,脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度的增加說(shuō)明四環(huán)素的出現會(huì )加劇污水處理系統中金屬管材的腐蝕;因此,在處理四環(huán)素污水時(shí),應充分重視處理系統中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多而造成的損失。
格室1 內的寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、格室3 內的梭菌屬(Clostridium)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)隨著(zhù)四環(huán)素的添加,豐度先減小后增加,如表2 所示,在四環(huán)素添加初期,這些微生物物種在相應格室內受到的抑制作用較大,隨著(zhù)時(shí)間的推移,所受抑制作用減弱,耐藥性增加,說(shuō)明四環(huán)素的長(cháng)期污染能使微生物的耐藥性發(fā)生改變。
表1 豐度隨四環(huán)素添加而增大的物種的豐度變化值
表2 豐度隨四環(huán)素添加先減小后增大的物種的豐度變化值
2. 3 樣本的主坐標分析( PCoA) 和聚類(lèi)分析
主坐標分析(PCoA)能展示各個(gè)樣本間的差異大小,2 個(gè)樣本在坐標軸上的距離較近,則表示這2 個(gè)樣本的物種組成較相似。圖5 反映了未添加四環(huán)素時(shí)和添加四環(huán)素后樣本間物種的差異大小�？梢钥闯�,主成分1 ( PC1) 和主成分2 ( PC2) 是造成樣品的2 個(gè)最大差異特征,貢獻率分別為25. 82% 和11. 86% 。未添加四環(huán)素時(shí),C1、C2、C3 的樣本分別聚在一起,C1 和C2 樣本之間距離較近,且和C3 距離較遠,說(shuō)明未添加四環(huán)素時(shí),C1 和C2 的物種相似性較高,且這2 個(gè)格室的物種和C3 格室物種有一定差異。添加四環(huán)素后,C1 和C3 物種在初期有個(gè)漸變的過(guò)程,后期3 個(gè)格室的樣本聚在一起,且與未添加四環(huán)素時(shí)有一定距離,說(shuō)明四環(huán)素添加前后格室內物種有較大差異,且隨著(zhù)四環(huán)素的添加,3 個(gè)格室間的物種組成相似性提高。
樣品聚類(lèi)分析圖(圖6) 進(jìn)一步說(shuō)明PCoA 的結果,樣品越靠近,枝長(cháng)越短,說(shuō)明2 個(gè)樣品的物種組成越相似。由圖6 可以看出,未添加四環(huán)素時(shí),C1 和C2 格室樣品距離較近,枝長(cháng)較短,說(shuō)明這2 個(gè)格室間物種相似性較高,而C3 格室的樣品在另一個(gè)分支上,距離較遠,枝長(cháng)較長(cháng),說(shuō)明C3 格室的物種與C1、C2 格室的物種具有一定的差異。隨著(zhù)四環(huán)素的添加,C1 和C3 樣本在初期有個(gè)遠離的過(guò)程,說(shuō)明物種有個(gè)漸變的過(guò)程,在后期3 個(gè)格室的樣本距離縮短,相互間枝長(cháng)變短,說(shuō)明在后期3 個(gè)格室物種相似性增大,且添加四環(huán)素后的3 個(gè)格室樣本與未添加四環(huán)素時(shí)的樣本分別位于不同的大分支上,說(shuō)明四環(huán)素的添加使反應器內微生物產(chǎn)生較大變化。
主坐標分析(PCoA) 和樣品聚類(lèi)分析共同說(shuō)明了四環(huán)素添加前后反應器內的微生物的物種組成具有較大差異,四環(huán)素添加后,隨著(zhù)運行時(shí)間的推移,格室間微生物的物種組成相似性增大。產(chǎn)生這種現象主要原因是:由于四環(huán)素耐藥物種的存在,使四環(huán)素添加后不具有四環(huán)素耐藥性的物種逐漸被四環(huán)素耐藥物種取代,隨著(zhù)運行時(shí)間的推移,各格室內耐藥物種增多,所以格室間物種相似性增大;由于耐藥物種逐漸取代了不耐藥物種,所以四環(huán)素添加前后反應器內微生物物種組成有較大差異。說(shuō)明長(cháng)期受抗生素污染的污水處理系統對微生物具有選擇性,使微生物群落結構發(fā)生變化,進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統的不利影響。具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結論
本實(shí)驗采用實(shí)驗室人工配置污水,對具有3 個(gè)格室的ABR 進(jìn)行連續流實(shí)驗,啟動(dòng)反應器達到穩定狀態(tài)后, 分別在無(wú)四環(huán)素配置污水和濃度為250μg·L - 1 的四環(huán)配置污水環(huán)境下運行反應器90 d,探討2 種條件下氫氣(H2 )、甲烷(CH4 )產(chǎn)量的變化,并運用Illumina MiSeq 高通量測序方法從微觀(guān)上揭示上述變化的原因。主要研究結果如下:1) 四環(huán)素的添加能使氫氣產(chǎn)量增加,四環(huán)素對產(chǎn)甲烷的抑制作用隨著(zhù)時(shí)間的推移增大;2)Illumina MiSeq 測序獲得反應器內的序列所屬16 個(gè)屬,其中,密螺旋體屬(Treponema)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、互營(yíng)桿菌屬(Syntrophobacter)、W22 對四環(huán)素具有一定耐藥性;3)格室1 內的寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、格室3 內的梭菌屬(Clostridium)和甲烷桿菌屬(Methanobacterium)對四環(huán)素的耐藥性隨著(zhù)四環(huán)素污染時(shí)間的推移,耐藥性增加,說(shuō)明四環(huán)素長(cháng)期的污染能引起微生物的耐藥性發(fā)生改變;在處理四環(huán)素污水時(shí),可以通過(guò)以下調控趨利避害:充分利用密螺旋體屬(Treponema)的優(yōu)勢,增加乙酸積累,可以通過(guò)耦合系統將乙酸轉化為微生物燃料電池能源或作為發(fā)酵工業(yè)的原料,實(shí)現資源回收,在處理四環(huán)素污水時(shí),可以加強氫氣的回收利用,減小污水處理成本;硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多會(huì )加劇污水處理系統中金屬管材的腐蝕,因此應充分重視處理系統中金屬管材的防腐措施,減少因脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)增多而造成的損失;4)PCoA 分析和聚類(lèi)分析結果表明,四環(huán)素添加前后系統內物種組成具有較大差異,四環(huán)素的添加引起了具有四環(huán)素耐藥性物種逐漸取代不具有四環(huán)素耐藥性物種,隨著(zhù)運行時(shí)間的推移,格室間物種相似性增大,說(shuō)明長(cháng)期受抗生素污染的污水處理系統對微生物具有選擇性,使微生物群落結構發(fā)生變化,進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)污泥馴化能減小抗生素對污水處理系統的不利影響。
