在污水處理中，由于硝化細菌是自養異養細菌且生長(cháng)緩慢，容易流失，所以近年來(lái)固定化微生物技術(shù)的應用越來(lái)越受到人們的關(guān)注.固定化微生物技術(shù)是通過(guò)化學(xué)或物理的手段, 將微生物細菌限定于載體空間區域內，保持其活性并且可以反復利用.與傳統生物處理法相比，固定化微生物技術(shù)具有微生物流失少、污泥產(chǎn)量少、抗沖擊負荷能力強等優(yōu)點(diǎn)，可以包埋預先篩選出的特種菌種，運用于污水處理系統中.目前，包埋固定化硝化細菌處理氨氮廢水成為國內外學(xué)者的研究焦點(diǎn).郝婧所用的包埋固定化硝化細菌處理高氨氮廢水，在反應溫度為28~30℃，pH為8.2，包埋顆粒體積填充率為25%的條件下，氨氧化速率最高約30 mg·(L·h)-1.賴(lài)鼎東利用固定化氨氧化細菌進(jìn)行含氮廢水短程硝化時(shí)發(fā)現，溫度為30℃，pH為8.5時(shí)亞硝酸鹽氮積累率可達90%以上，氨氧化速率最高約為7.9 mg·(L·h)-1.Inoue等以聚乙烯醇為載體固定硝化細菌，填充率為50%時(shí)處理低溫氨氮廢水，硝化速率為17 mg·(L·h)-1.由此可見(jiàn)包埋硝化細菌處理氨氮廢水反應效率通常較低，且包埋后需嚴格控制反應條件，達到亞硝酸鹽氮的高積累.
因此，包埋硝化細菌實(shí)現短程硝化是可行的.但硝化細菌中氨氧化細菌含量較少，嚴重影響了硝化速率.為此，本實(shí)驗研究氨氧化細菌的包埋固定化.以水廠(chǎng)回流污泥為菌源，定向篩選AOB并淘汰NOB，以期達到細菌包埋完成后能實(shí)現較高的氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率.
1 材料與方法1.1 污泥來(lái)源與實(shí)驗裝置
實(shí)驗污泥取自北京高碑店污水處理廠(chǎng)硝化污泥.污泥富集培養連續流裝置見(jiàn)圖 1，反應池有效容積22 L.
圖 1 污泥富集培養裝置示意
污泥富集培養實(shí)驗采用人工模擬氨氮廢水，主要成分有: NH4Cl(投加量取決于NH4+-N濃度)，Na2CO3(投加量取決于NH4+-N濃度)，K2HPO4、KH2PO4(投加量取決于NH4+-N濃度，其中N:P為5)，MgSO4·7H2O(20mg·L-1)，CaCl2·2H2O(10mg·L-1).每升進(jìn)水中加入0.5 mL微量元素，其中ZnSO4·7H2O(0.12 mg·L-1)，NaMoO4·2H2O(0.12mg·L-1)，CoCl2·6H2O(0.15mg·L-1)，MnSO4·H2O(0.12mg·L-1)，NiCl2·6H2O(0.120 mg·L-1)，CuSO4·5H2O(0.03mg·L-1)和FeCl3·6H2O(1.5 mg·L-1).
培養過(guò)程中反應溫度控制在25℃，DO為1~1.5 mg·L-1范圍內，pH為8~8.4.實(shí)驗起始時(shí)MLSS為4 030 mg·L-1，MLVSS為2 473 mg·L-1，實(shí)驗過(guò)程中每天連續排泥.初期進(jìn)水氨氮濃度為100 mg·L-1，后逐步提高至700 mg·L-1.水力停留時(shí)間由4 h縮短到2 h.
1.2 包埋填料的制備與應用
按照本實(shí)驗室成熟的包埋技術(shù)，取7 L富集培養后的污泥進(jìn)行離心濃縮，加入膠狀體聚乙烯醇(PVA)混合制成包埋液，均勻涂裝在條狀載體上，包埋液中PVA與濃縮污泥的濃度分別為10%和25%.以硼酸和無(wú)水硫酸鈉為交聯(lián)劑交聯(lián)4 h.包埋連續流裝置同上，包埋填料填充率為8%.實(shí)驗采用人工模擬氨氮廢水，其構成同上.實(shí)驗在室溫下進(jìn)行，反應pH為7.2~8，DO為2~4 mg·L-1之間.實(shí)驗進(jìn)水氨氮濃度由50 mg·L-1逐步提高至250 mg·L-1，HRT為4 h.為適應高碑店污水處理廠(chǎng)的實(shí)際進(jìn)水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩定后，降低進(jìn)水氨氮濃度至30~40 mg·L-1，并縮短水力停留時(shí)間至2 h.
1.3 實(shí)驗分析方法1.3.1 高通量測序分析方法
取原始污泥混合液和富集培養后的污泥混合液分別標記為Yu01和Yu02，提取DNA并對樣本16S rRNA的V3-V4區域進(jìn)行PCR擴增.
采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量測序平臺對樣品進(jìn)行測序.針對測序數據進(jìn)行環(huán)境微生物的16S分析，首先對原始的paired-end reads進(jìn)行過(guò)濾得到高質(zhì)量reads，然后通過(guò)序列拼接得到較長(cháng)的序列，將其與16S參考數據庫作比對，同時(shí)去除嵌合體序列，最終將過(guò)濾后的序列按照一定的閾值進(jìn)行歸類(lèi)，得到多個(gè)序列聚類(lèi)操作分類(lèi)單元(OTUs)，設定閾值的序列相似性為0.97分為同一類(lèi)，分成的一個(gè)類(lèi)就是一個(gè)OTU，代表一個(gè)種.接著(zhù)根據OTUs結果進(jìn)行α多樣性的計算. α多樣性指標包括豐富度指數(ACE)、多樣性指數(Shannon、Simpson)、goods_coverage和observed_species等.其中豐富度衡量單個(gè)樣本中物種種類(lèi)個(gè)數，實(shí)際通過(guò)估算OTU的個(gè)數來(lái)衡量;多樣性指數衡量群落的異質(zhì)性. goods_coverage表示樣品文庫的覆蓋率，即測序深度指數，其數值越高，則樣本中序列沒(méi)有被測出的概率越低. Observed_species代表該樣品中OTU的個(gè)數.
1.3.2 其他分析方法
NH4+-N采用納氏試劑分光光度法測定;NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定;NO3--N采用紫外分光光度法測定;pH采用SX711便攜式pH計測定;溶解氧采用JPSJ-605F型溶解氧儀測定.
2 結果與討論2.1 氨氧化細菌富集培養階段結果及分析2.1.1 進(jìn)水氨氮濃度與污泥比氨氧化速率變化情況分析
從圖 2可以看出，反應起始階段(1~5 d)進(jìn)水氨氮控制在100 mg·L-1，HRT為4 h，污泥比氨氧化速率開(kāi)始由0.103 g·(g·d)-1緩慢增長(cháng)至0.348 g·(g·d)-1.此時(shí)還處于活性恢復階段，為了提高污泥比氨氧化速率，從第6 d開(kāi)始提高進(jìn)水氨氮濃度并將HRT縮短為3 h.至第22 d，由于污泥比氨氧化速率增長(cháng)較快，提高進(jìn)水氨氮濃度至400 mg·L-1并同時(shí)縮短HRT至2 h并保持不變.
圖 2 污泥進(jìn)水氨氮濃度及污泥比氨氧化速率變化
經(jīng)過(guò)30 d的富集培養，污泥比氨氧化速率呈對數增長(cháng)至1.368 g·(g·d)-1.隨著(zhù)污泥比氨氧化速率的不斷提高，在水力停留時(shí)間2 h內出水氨氮濃度逐漸減小為零，此時(shí)反應較易向全程硝化轉化.所以繼續增加進(jìn)水氨氮濃度至500 mg·L-1，此時(shí)污泥比氨氧化速率增長(cháng)緩慢，說(shuō)明高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定抑制作用.而后繼續增加進(jìn)水氨氮濃度至700 mg·L-1，可以發(fā)現在短暫的適應期過(guò)后，污泥比氨氧化速率繼續增長(cháng)，最終高達2.028 g·(g·d)-1.污泥比氨氧化速率的持續增長(cháng)可以證明富集培養階段氨氧化細菌活性不斷增強.
2.1.2 污泥濃度變化情況分析
由于反應體系中始終保持著(zhù)較高濃度的亞硝酸鹽氮，作為NOB的反應底物，亞硝酸鹽氮的積累對NOB的生長(cháng)有一定的促進(jìn)作用.為了將NOB徹底淘洗出去，實(shí)驗過(guò)程中每天不斷排泥.從圖 3可以看出，前23 d系統中MLVSS不斷增長(cháng)，這是由于前期排泥量較小.為保持系統中穩定的污泥濃度，第24 d開(kāi)始加大排泥量，污泥濃度逐漸減小，至第35 d基本穩定.盡管每天不間斷排泥，系統總污泥濃度仍不間斷增長(cháng)，后由高通量測序可知污泥中氨氧化細菌大量增長(cháng).
圖 3 污泥濃度變化
2.1.3 污泥亞硝酸鹽氮積累率變化情況分析
從圖 4可以看出，反應起始階段(1~5 d)亞硝酸鹽氮積累率由33%迅速增長(cháng)至70%.從第6 d開(kāi)始提高進(jìn)水氨氮濃度后，亞硝酸鹽氮積累率進(jìn)一步增加至85%以上并逐漸穩定.此后由于氨氮濃度不斷提高，FA對NOB的抑制作用不斷增大，且每天不間斷地排泥，致使NOB活性越來(lái)越低且數量越來(lái)越少.而此時(shí)氨氧化細菌大量增長(cháng)且活性不斷增強，在系統中占有明顯的生態(tài)優(yōu)勢.這使得亞硝酸鹽氮積累率從第20 d起始終保持在90%以上.
圖 4 污泥亞氮積累率變化
本實(shí)驗進(jìn)行至第60 d，污泥比氨氧化速率的高表達和亞硝酸鹽氮的高積累已達到預期效果，此時(shí)取污泥樣品進(jìn)行高通量測序，結果表明氨氧化細菌已成為優(yōu)勢菌種，可以進(jìn)行后續包埋實(shí)驗.另外，本實(shí)驗污泥富集培養階段出水用于反硝化實(shí)驗，脫氮后排放.
2.1.4 污泥多樣性及菌群變化分析
通過(guò)對兩組樣品16S rRNA基因文庫高通量測序，污泥原樣(Yu01) 與富集培養后的污泥樣品(Yu02) α多樣性指標計算結果見(jiàn)表 1.
表 1 α多樣性指標計算結果
由表 1可知，兩個(gè)樣品的文庫覆蓋率均大于0.98，表明測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有的物種. Yu01的Shannon多樣性指數和Simpson多樣性指數大于Yu02，說(shuō)明原污泥群落多樣性高于篩選后的污泥.多樣性指數較高的原始污泥群落各種之間個(gè)體分配較均勻，而篩選后的污泥各種之間生物量差異較大，優(yōu)勢種群明顯.
為了更深入研究系統的優(yōu)勢菌種，計算每個(gè)樣本在屬級的相對豐富度. 表 2、表 3列出了每個(gè)樣品前三類(lèi)優(yōu)勢菌屬及與硝化作用相關(guān)的Nitrospira和Nitrosomonas所占百分比及系統分類(lèi).
表 2 Yu01優(yōu)勢菌屬
表 3 Yu02優(yōu)勢菌屬
與常規分子生物學(xué)手段相比，高通量測序可以提供更豐富的微生物信息.盡管如此，Yu01與Yu02仍有50.5%與51.4%的序列無(wú)法歸入已知細菌屬.原泥樣品菌群分布較均勻，均為廢水處理系統中的常見(jiàn)菌種.其中與硝化作用相關(guān)的為Nitrospira和Nitrosomonas.已知的Nitrospira菌屬為硝酸鹽氧化細菌，Nitrosomonas菌屬為氨氧化細菌，前者為后者的11.25倍.篩選后的污泥樣品中，Nitrosomonas成為優(yōu)勢菌，這與Wells等的研究結果一致，即絕大多數反應器中Nitrosomonas是AOB的優(yōu)勢菌種.而Nitrospira僅占系統的0.02%，此時(shí)Nitrosomonas是Nitrospira的900倍.
2.2 包埋氨氧化細菌短程硝化階段結果及分析2.2.1 包埋填料短程硝化效率與亞氮積累率變化情況
對包埋填料進(jìn)行活性恢復.由圖 5可知起始階段系統進(jìn)水氨氮濃度為50 mg·L-1，氨氧化速率由1 mg·(L·h)-1緩慢增加至6 mg·(L·h)-1.此時(shí)氨氧化速率較低，從第12 d起為提高反應速率將進(jìn)水氨氮濃度增加至100 mg·L-1，可以發(fā)現隨著(zhù)氨氮濃度的增加，氨氧化速率增長(cháng)加快，至第19 d迅速增長(cháng)至20 mg·(L·h)-1.因此，通過(guò)逐步增加進(jìn)水氨氮濃度的方法提高氨氧化速率是可行的.此后繼續階段性地提高進(jìn)水氨氮濃度至250 mg·L-1，氨氧化速率最可高達50 mg·(L·h)-1.
圖 5 包埋填料氨氧化速率變化
從圖 6可以看出，實(shí)驗過(guò)程中系統始終保持95%以上亞硝酸鹽氮積累率.證明系統中氨氧化細菌始終保持著(zhù)絕對的生態(tài)優(yōu)勢.由此可以證明，包埋固定本實(shí)驗篩選后的氨氧化細菌有利于實(shí)現硝化系統中穩定的亞硝酸鹽氮積累.
圖 6 包埋填料亞氮積累率變化曲線(xiàn)
2.2.2 模擬水廠(chǎng)進(jìn)水氨氮濃度下的處理效果
為適應高碑店污水處理廠(chǎng)的實(shí)際進(jìn)水氨氮濃度，在氨氧化速率和亞硝酸鹽氮積累率穩定后，降低進(jìn)水氨氮濃度至30~40 mg·L-1.由圖 7、8可以看出，系統始終保持著(zhù)90%以上的氨氮去除率以及亞硝酸鹽氮積累率.
圖 7 系統氨氮去除率變化
圖 8 系統亞氮積累率變化
3 結論
(1) 采用連續流運行方式逐步提高進(jìn)水氨氮濃度，可以促進(jìn)氨氧化細菌活性的增強并使之大量增長(cháng)，從而大大地提高氨氧化速率，但高濃度氨氮對氨氧化細菌的活性有一定的抑制作用.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
(2) 固定化富集培養后的氨氧化細菌，反應器包埋填充率為8%時(shí)，氨氧化速率最高可達50 mg·(L·h)-1，亞硝酸鹽氮積累率穩定在90%以上.
(3) 用包埋填料處理水廠(chǎng)模擬污水，氨氮去除率和亞硝酸鹽氮積累率均可保持在90%以上.
