菌株L-1不同接種量對模擬廢水(25mg·L-1)最佳處理效果

　　1 引言

　　氯苯類(lèi)化合物作為農藥及染料合成中間體、清洗溶劑及脫脂劑成分廣泛使用.自然界微生物缺乏降解此類(lèi)化合物的酶或酶系統，很難進(jìn)行生物處理，微生物降解菌的篩選和降解性能研究是實(shí)現生物降解持久性有機污染物的關(guān)鍵.1，2，3，4-TeCB在GB 6944—2005中危險標記為14(有毒物品)，是一種典型的氯苯類(lèi)化合物，對人體的皮膚、上呼吸道和粘膜有刺激作用，可在人體內積累.目前四氯苯的研究主要圍繞其物理特性和毒性.四氯苯的晶體結構和混合晶體結構，在水和空氣之間的傳質(zhì)作用，沉積物和懸浮物對1，2，3，4-TeCB的吸附作用，1，2，3，4-TeCB對孕鼠肝和生殖率影響等均有廣泛研究.對于低分子氯苯類(lèi)化合物及首先被限制使用的六氯苯微生物降解已有一些報道.但關(guān)于TeCBs的微生物降解研究卻鮮有報道.研究發(fā)現，五氯苯、六氯苯在降解過(guò)程中往往存在1，2，3，4-TeCB中間產(chǎn)物，這表明1，2，3，4-TeCB的降解是高氯苯化合物降解的關(guān)鍵步驟.本文從某氯苯試劑廠(chǎng)的土壤中取樣，篩選出一株以1，2，3，4-TeCB作為唯一碳源的降解菌，并研究了該菌株對1，2，3，4-TeCB降解效果及降解途徑，為微生物降解氯苯類(lèi)物質(zhì)提供實(shí)驗依據.

　　2 材料和方法

　　2.1 原料與試劑

　　所用土樣取自廣東某化學(xué)試劑廠(chǎng)長(cháng)期受四氯苯污染的土壤作為菌株分離源.

　　化學(xué)試劑：1，2，3，4-TeCB、丙酮、正己烷等試劑均為優(yōu)級純.培養基：常規牛肉膏蛋白胨;無(wú)機鹽培養基(組分不含Cl-)均為常規配方(試劑均為分析純)

　　2.2 主要實(shí)驗儀器

　　生化培養箱;恒溫水浴振蕩器;超凈工作臺;高速離心機;COD消解儀;離子色譜儀;高效液相色譜;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀.

　　2.3 菌種富集和分離純化

　　取1 g土壤于100 mL蒸餾水 中，搖床振蕩15 min，樣品稀釋后直接涂布在100 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB的無(wú)機鹽培養基.待長(cháng)出菌落后，挑取單菌落在高濃度(250 mg · L-1)1，2，3，4-TeCB的液體培養基馴化.經(jīng)過(guò)5~7 d馴化后(定期更換培養液)，取1~2 mL菌液涂布于1，2，3，4-TeCB為唯一碳源的無(wú)機鹽平板，30 ℃恒溫培養，挑選生長(cháng)較快的單菌落接種到100 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB液體無(wú)機鹽培養基中振蕩培養;多次平板劃線(xiàn)分離，獲得單菌落.

　　2.4 菌株形態(tài)觀(guān)察、生長(cháng)曲線(xiàn)及16S rDNA序列分析

　　將純化后的菌株在固體培養基上進(jìn)行劃線(xiàn)培養，待長(cháng)出單個(gè)菌落后進(jìn)行形態(tài)觀(guān)察;對菌株進(jìn)行革蘭氏染色觀(guān)察;用OD600處測定生長(cháng)曲線(xiàn).PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分析檢測后將PCR產(chǎn)物送至廣州工業(yè)微生物檢測中心回收并測序.

　　2.5 菌株對1，2，3，4-四氯苯降解效果的研究

　　實(shí)驗所用廢水為25 mg · L-1 1，2，3，4-TeCB模擬廢水，pH 7.

　　取200 mL無(wú)機鹽培養基置于500 mL錐形瓶中，經(jīng)高溫滅菌后，配置成25 mg · L-1的模擬廢水，分別加入2%、3%、5%的菌懸液.30 ℃，110 r · min-1.接種后每天定時(shí)取樣.分別測定模擬培養液中COD、Cl-濃度、1，2，3，4-TeCB濃度的影響，連續測定7 d.每組3個(gè)平行.

　　1)COD測定：快速消解分光光度法.

　　2)氯離子濃度測定：樣品測定前，樣品經(jīng)過(guò)0.22 μm 微孔過(guò)濾膜，用離子色譜儀測定氯離子濃度.

　　3)1，2，3，4-TeCB濃度測定：用高效液相測定.前處理：廢水經(jīng)0.22 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，測定過(guò)濾液中1，2，3，4-TeCB.測定條件：TH 1015型C18酸性柱;流動(dòng)相為甲醇與水按85:15體積比混合;柱溫25 ℃;進(jìn)樣體積10 μL;雙波長(cháng)檢測：波長(cháng)為214 nm、216 nm.

　　2.6 降解特性分析

　　不同處理時(shí)間的廢水經(jīng)0.22 μm 微孔過(guò)濾膜過(guò)濾，吹掃捕集后，利用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測定氯苯降解情況及產(chǎn)物分析.吹掃捕集條件：吹脫時(shí)間：11 min;吹脫溫度：350 ℃;解析溫度：225 ℃;解析時(shí)間：6 min;烘烤溫度：235 ℃;烘烤時(shí)間：5 min.注入樣品5 mL.色譜條件：檢測器溫度：300 ℃;進(jìn)樣口溫度：260 ℃;柱箱溫度：起始60 ℃，保持2分鐘，以5 ℃ · min-1的速度升溫至160 ℃，保持2 min.分流比：10 ∶ 1.

　　3 結果與分析

　　3.1 菌株生理生化特性、16S rDNA序列分析及生長(cháng)曲線(xiàn)

　　以1，2，3，4-TeCB為唯一碳源富集、分離、馴化微生物，篩選出一株在固體培養基上能快速生長(cháng)的菌株，命名為L(cháng)-1號菌.菌落表面圓滑，不透明，呈白色或微黃色.菌株為短桿狀，無(wú)鞭毛，能運動(dòng)，能產(chǎn)生中生芽孢.菌株革蘭氏染色結果為陽(yáng)性菌(G+)，如圖 1所示.在此基礎上，對L-1號菌的16SrDNA基因系列運用Basics BLAST軟件分析，和Genbank比對，L-1菌ITS序列與Bacillus subtilis AF0907(枯草芽孢桿菌)和Bacillus carboniphilus JCM9731具有最高的同源性，均達到98.5%以上.結合生理生化特性，初步鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌.為了解菌株生長(cháng)特點(diǎn)，對L-1號菌進(jìn)行生長(cháng)曲線(xiàn)的測定，見(jiàn)圖 2.

 圖1 菌株 L-1 的菌落形態(tài)和革蘭氏染色

 
圖2 菌株 L-1 的生長(cháng)曲線(xiàn)

　　從圖 2中可見(jiàn)該菌株在0~3 h生長(cháng)較慢，5 h后迅速進(jìn)入生長(cháng)期，表明該菌株潛伏期較短能夠快速適應生長(cháng)環(huán)境，進(jìn)入對數生長(cháng)期.12~34 h該菌株生長(cháng)減慢，進(jìn)入穩定期，直到30 h后該菌株一直處于穩定期，表明該菌株生長(cháng)代謝穩定期長(cháng)，降解潛能較大，利于工業(yè)應用.在菌株培養了15 h后，菌的濃度能達到約108 cfu.為實(shí)驗用菌提供保證.

　　3.2 不同接種量對反應液COD的影響

　　將菌株制成菌懸液(108 cfu)，測定不同接種量對25 mg · L-1模擬廢水COD降解效果，初步反映菌液中有機污染物的量，結果見(jiàn)圖 3.

 圖3 接種量對廢水COD累積降解率的影響

　　從圖 3可見(jiàn)，隨著(zhù)時(shí)間增長(cháng)，反應液COD累積降解率逐漸增大，接種濃度越大降解率越高.7 d后降解率分別達到：32.61%;53.79%;62.71%.在第1~2 d時(shí)，菌株生長(cháng)處于對數期，降解效果好，反應液COD降解較快.在第3 d后水中COD累積降解率穩步增加，菌株生長(cháng)趨于穩定.3~7 d COD累積降解率斜率基本一致，表明單位時(shí)間菌體的降解效率穩定.與圖 2中菌株生長(cháng)曲線(xiàn)相對應.說(shuō)明L-1菌株生長(cháng)代謝穩定強，能充分利用廢水中的有機物.說(shuō)明該菌株并不能迅速的將1，2，3，4-TeCB完全礦化.在5 d后COD降解率逐漸減緩，但能保持一定的降解效果.

　　3.3 不同接種量對氯離子釋放量的影響

　　在配制模擬廢水時(shí)，無(wú)機鹽培養基中不含Cl-，反應液中的氯離子含量多少反映了降解過(guò)程中對1，2，3，4-TeCB的降解脫氯過(guò)程，結果見(jiàn)圖 4.

 圖4 接種量對氯離子釋放濃度的影響

　　從圖 4可以看出氯離子釋放濃度趨勢與COD降解呈一定的相關(guān)性.在1~4 d，氯離子隨菌濃度增大，氯離子釋放量濃度增大.這表明菌株在1，2，3，4-TeCB降解的過(guò)程中確實(shí)有Cl-產(chǎn)生.且接種量越大，氯離子的釋放越多.但在5 d后氯離子釋放量，再次呈現快速增長(cháng)，表明該菌有可能使1，2，3，4-TeCB釋放多個(gè)氯離子，可能使三氯或者二氯化合物脫氯.因此氯離子濃度的變換呈現二次增長(cháng)趨勢.不同接種量反應液中的氯離子濃度在7 d時(shí)的含量分別為：1.852 mg · L-1，2.742 mg · L-1，4.980 mg · L-1.

　　3.4 不同接種量對1，2，3，4-TeCB的降解量

　　從圖 5中可以看出，1，2，3，4-TeCB的降解量隨著(zhù)時(shí)間的增加而增大，呈現一定的時(shí)間-效應關(guān)系，且菌株接種量大降解率高.2%、3%、5%接種量7 d后降解量可達13.74 mg · L-1，14.91 mg · L-1，20.47 mg · L-1.第1~4 d，盡管微生物量增多，但是菌株降解速率較慢，這可能與菌株尚沒(méi)有合成降解1，2，3，4-TeCB相應的酶有關(guān).第4~6 d，1，2，3，4-TeCB的降解量逐漸加大.表明菌株逐漸適應新的脅迫環(huán)境.到7 d降解量變化不大，表明菌株生長(cháng)所需有機物逐漸減少，降解效果也隨著(zhù)下降.該結果與COD量變化不同，菌株COD在第7 d時(shí)最高只降解62%，這表明該菌株能利用1，2，3，4-TeCB，但對1，2，3，4-TeCB的完全礦化需要一個(gè)過(guò)程，該結果正好與氯離子的二次釋放相吻合.

 圖5 不同接種量對1，2，3，4-TeCB降解量

　　3.5 加標回收率與RSD和GC-MS產(chǎn)物分析

　　進(jìn)一步分析L-1菌株對1，2，3，4-TeCB的降解產(chǎn)物的特性，樣品的加標回收率見(jiàn)表 2.

 表2 樣品的加標回收率與RSD

　　通過(guò)對反應液GC-MS測定和分析，發(fā)現1，2，3，4-TeCB降解過(guò)程中存在：2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸(A物質(zhì))和2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內酯-己酸(B物質(zhì)).圖 6(a、b)分別是A、B物質(zhì)的質(zhì)譜圖.

 圖6 A、B物質(zhì)的相對豐度

　　通過(guò)對廢水pH的測定，反應液從pH 7降低到pH 5.3，說(shuō)明最終產(chǎn)物中生成了酸性物質(zhì).通過(guò)對產(chǎn)物的分析，推測1，2，3，4-TeCB降解途徑是先通過(guò)開(kāi)環(huán)后脫氯的途徑.通過(guò)對其降解途徑分析如圖 7所示.

 圖7 菌株L-1對1，2，3，4-TeCB的降解途徑

　　1，2，3，4-TeCB在加氫氧化酶的作用下產(chǎn)生環(huán)雙氧化，生成環(huán)氯代二醇，然后在脫氫酶的作用下脫去兩個(gè)氫原子生成3，4，5，6-四氯鄰苯二酚;再經(jīng)過(guò)氧化開(kāi)環(huán)生成2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸，并在相關(guān)酶的作用下發(fā)生內酯化脫去氯離子生成2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內酯-己酸，之后通過(guò)水解酶生成2，3，5-二氯-4-氧代-2-烯己二酸，這種化合物能在NADH作用下打開(kāi)雙鍵同時(shí)脫氯，形成飽和脂肪酸，最后生成琥珀酸和乙酸，最終進(jìn)入TCA循環(huán).該中間化合物大部分在反應液中檢測出來(lái)，證實(shí)了該降解途徑的可行性及該菌種研究的潛在價(jià)值.關(guān)于菌株L-1的其他生理生化特性及菌種鑒定值得進(jìn)一步深入研究.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結論

　　1)從廣東某化學(xué)試劑廠(chǎng)周邊土壤篩選出一株能降解1，2，3，4-TeCB的菌株L-1，該菌株為短桿狀，能產(chǎn)生芽胞的革蘭氏陽(yáng)性菌，經(jīng)16S rDNA鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌.

　　2)菌株L-1不同接種量對模擬廢水(25 mg · L-1)的最佳處理效果：COD降解率達62.71%，氯離子濃度達4.980 mg · L-1;1，2，3，4-TeCB降解量高達20.47 mg · L-1.

　　3)廢水的COD降解率隨接種量增大和接種時(shí)間延長(cháng)逐漸升高;1，2，3，4-TeCB降解過(guò)程中有Cl-產(chǎn)生，且呈現二次增長(cháng)的現象;反應液中1，2，3，4-TeCB濃度隨著(zhù)接種時(shí)間逐漸降低，在第7 d 5%接種量處理組的降解量最大，高達20.47 mg · L-1，證實(shí)該L-1菌株能夠降解1，2，3，4-TeCB，但其完全礦化過(guò)程比較復雜.

　　4)通過(guò)GC-MS等分析發(fā)現1，2，3，4-TeCB的降解過(guò)程中存在2，3，4，5-四氯-2，4-己二烯二酸和2，3，5-三氯-2，4-二烯-1，4-內酯-己酸兩種關(guān)鍵物質(zhì).推測其降解過(guò)程是先開(kāi)環(huán)后脫氯.