剩余污泥中纖維素半纖維素微生物降解技術(shù)

　　1 引言

　　剩余污泥中存在著(zhù)相當數量難以生物降解的木質(zhì)纖維素.一方面，這些木質(zhì)纖維素難以在厭氧消化過(guò)程中被降解、轉化，使得能源(甲烷)產(chǎn)率過(guò)低.另一方面，殘留在消化污泥中的木質(zhì)纖維素也阻礙污泥減量，為污泥填埋處置形成潛在隱患(Mottet et al., 2010).

　　研究表明，木質(zhì)纖維素是一種由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成的聚合物.其中，木質(zhì)素最難降解，且在厭氧條件下無(wú)法實(shí)現有效降解;而纖維素和半纖維素相對容易降解并轉化.如果能實(shí)現木質(zhì)纖維素其中2組分(纖維素、半纖維素)完全降解，不僅污泥能源轉化率將會(huì )提高，而且也會(huì )對污泥減量起到一定的促進(jìn)作用.污泥厭氧消化實(shí)踐表明，傳統厭氧消化幾乎對木質(zhì)纖維素沒(méi)有降解.這表明，傳統厭氧消化系統中很少或幾乎不存在降解復雜化學(xué)結構木質(zhì)纖維素的微生物.

　　面對上述實(shí)際情況，本研究旨在通過(guò)微生物富集培養方法去探知消化污泥中是否存在可降解纖維素/半纖維素的厭氧微生物，為后續研究污泥中木質(zhì)纖維素厭氧生物降解奠定實(shí)驗基礎.如上述，纖維素和半纖維素生物降解相對容易，這是因為這2種組分在結構上具有一定的相似性，如木聚糖(半纖維素主要成分)和纖維素都是由單糖經(jīng)β-1，4糖苷鍵鏈接而成，它們的降解均是依靠胞外酶打破β-1，4糖苷鍵而實(shí)現.可見(jiàn)，可以通過(guò)富集培養降解一種物質(zhì)的微生物便可實(shí)現對木質(zhì)纖維素2種組分的同步降解.本研究中微生物富集培養實(shí)驗也就由此開(kāi)始.

　　2 實(shí)驗材料與方法

　　2.1 種泥與基質(zhì)

　　富集培養木質(zhì)纖維素厭氧生物種泥分別取自北京市某大型市政污水處理廠(chǎng)剩余污泥(實(shí)際污泥)與實(shí)驗室發(fā)酵罐中厭氧培養污泥(消化污泥).實(shí)際污泥為污水處理廠(chǎng)脫水后污泥(含水率：80%)，實(shí)驗時(shí)按需要濃度進(jìn)行兌水稀釋.消化污泥原污泥來(lái)源于實(shí)驗室一合成配水的SBR脫氮除磷中試裝置剩余污泥;用于消化污泥培養的發(fā)酵罐工作體積為4 L，在T=35 ℃、SRT=20 d、pH=7.0工況下運行.

　　選擇木聚糖作為木質(zhì)纖維素降解微生物富集培養的唯一基質(zhì)，因為它相對于纖維素來(lái)說(shuō)，結構疏松，無(wú)晶體結構，聚合度低，較容易被降解.

　　2.2 富集培養系統

　　富集培養采用系列平行搖瓶實(shí)驗，配備有密封橡膠塞的250 mL血清瓶作為富集培養系統.血清瓶置于空氣浴恒溫搖床(T=35 ℃;搖動(dòng)速度100 r · min-1)內進(jìn)行實(shí)驗.

　　兩種不同來(lái)源的種泥在血清瓶中的污泥濃度分別為：①實(shí)際污泥：MLSS≈22.28 g · L-1，MLVSS≈14.56 g · L-1;②消化污泥：MLSS≈22.37 g · L-1，MLVSS≈17.69 g · L-1.兩種污泥分別設置3個(gè)平行樣(編號：1、2、3)，并各設置1個(gè)不加基質(zhì)的空白樣瓶.實(shí)驗中，以6 d作為1個(gè)周期進(jìn)行底物置換，并進(jìn)行相應指標檢測，具體實(shí)驗方案列于表 1.細菌培養所需微量元素通過(guò)向血清瓶分別添加DIN EN ISO 11734 L47(簡(jiǎn)稱(chēng)L47)和DIN EN ISO 11734(簡(jiǎn)稱(chēng)M)培養液來(lái)補充，其成分見(jiàn)表 2.

 表1 微生物富集培養實(shí)驗方案 

 
表2 培養液組成

　　在富集實(shí)驗伊始，即使存在木聚糖降解類(lèi)微生物，它們也不是優(yōu)勢菌種.所以，木聚糖如能降解，首先會(huì )形成單糖，隨后會(huì )被占優(yōu)勢的產(chǎn)甲烷菌轉化為CH4和CO2.因此，可根據血清瓶產(chǎn)氣情況來(lái)作為木聚糖是否降解之指示.另外，木聚糖降解微生物主要是以分泌胞外酶的形式來(lái)水解木聚糖，且胞外酶之活性又與微生物的活性呈正比.故此，系統中的木聚糖酶活性可用作為一種指標，以此判斷系統中木聚糖降解微生物的生物活性.

　　2.3 氣體組分測定

　　實(shí)驗中采用氣相色譜儀(GC-2014型)檢測血清瓶中產(chǎn)生的甲烷等氣體，測定方法為外標法;選取標定物為高純度標準氫氣和甲烷制定標準曲線(xiàn)，如圖 1所示.

 圖 1 氣相色譜標準曲線(xiàn)

　　2.4 木聚糖酶活性測定

　　2.4.1 測定原理

　　木聚糖經(jīng)過(guò)木聚糖酶水解后會(huì )生成寡糖和單糖.由于寡糖具有還原性末端和單糖具有還原基團，所以，導致兩者在沸水浴條件下與DNS試劑會(huì )發(fā)生顯色反應.因顯色反應顏色強度與酶解產(chǎn)生的還原糖量成正比，且還原糖量又與待測液中木聚糖酶活性成正比，所以，可通過(guò)顯色反應強度來(lái)推算木聚糖酶活性.

　　2.4.2 測定方法

　　取 1%木聚糖標準溶液3.6 mL，滴入25 mL 具塞刻度試管中;加入0.4 mL適當稀釋的富集培養上清液，于35 ℃水浴鍋中保溫30 min;加入6 mL DNS溶液，混勻，沸水浴15 min;冷卻至室溫，定容到25 mL，在540 nm測定溶液吸光度.平行測定加入滅活上清液的空白對照組.

　　2.4.3 酶活性計算方法

　　木聚糖酶活性單位是指每min催化木聚糖水解生成1 μmol木糖所需的酶量，其中一個(gè)酶活性單位為U.酶活性計算公式(李彩霞等，2001)為：

　　式中，H為木聚糖酶酶活性(U · mL-1);D為酶液稀釋倍數;V1為比色管定容體積(mL);CX為木糖濃度(μmol · mL-1);T為反應時(shí)間(min);V2為酶液體積(mL).

　　2.4.4 標準曲線(xiàn)

　　采用高純度木聚糖溶液制定標準曲線(xiàn)(外標法)，標定溶液中木聚糖酶活性，測得的標準曲線(xiàn)如圖 2所示.該方法可準確地檢測出反應液中的木糖含量，從而可以根據計算公式推算出待測液中木聚糖酶活性.

 圖 2 木聚糖酶活性標準曲線(xiàn)

　　2.5 熒光顯微鏡鏡檢

　　本實(shí)驗，微生物實(shí)驗觀(guān)察采用熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 40，正置式)進(jìn)行，并配備了熒光激發(fā)光源和濾光片組，以確保紅、綠、藍色熒光觀(guān)察能夠正常進(jìn)行.此外，顯微鏡還配置以數碼相機，可實(shí)現對觀(guān)察到的微生物進(jìn)行實(shí)時(shí)拍攝，并隨之通過(guò)配置的AxioVision軟件進(jìn)行分析，以產(chǎn)生準確的數據信息.

　　2.6 熒光原位雜交(FISH)實(shí)驗

　　熒光原位雜交(FISH)被用于鑒定富集培養系統中細菌種類(lèi).首先，對測試泥樣用4%多聚甲醛固定2 h;再對固定后的泥樣離心，并在1×PBS 中重新懸浮(重復3次).其次，對泥樣進(jìn)行機械破碎，并將破碎泥樣滴加在明膠包被的載玻片上，分別用50%、80%和98%酒精浸泡3 min.再次，將熒光標記的寡核苷酸探針(見(jiàn)表 3)溶解于雜交緩沖液中(組成：0.9 mol · L-1 NaCl，0.02 mol · L-1Tris-HCl(pH=7.4)，0.01% SDS和35% 去離子甲酰胺(DFA))，并在46 ℃下與污泥樣品雜交2 h.雜交結束后，采用清洗液(組成：0.005 mol · L-1 EDTA(pH=8.0)，0.02 mol · L-1 Tris-HCl(pH=7.2)，0. 01%SDS和0.9 mol · L-1 NaCl)在48 ℃下洗脫20 min.最后，對每個(gè)污泥樣品用熒光顯微鏡(Zeiss Axioskop 40)隨機拍照并進(jìn)行定量分析.

 表3 鑒定木聚糖降解菌的寡核苷酸序列探針

　　2.7 細胞活性染色(LIVE/DEAD)

　　采用熒光染料對富集培養系統中的微生物進(jìn)行染色，以確定富集培養系統中微生物的細胞活性，操作方法見(jiàn)參考文獻(Invitrogen Molecular Probes，2004; Ziglio et al., 2002).

　　3 結果分析與討論

　　3.1 產(chǎn)氣情況

　　血清瓶富集培養系統產(chǎn)氣變化曲線(xiàn)示于圖 3，甲烷產(chǎn)氣變化曲線(xiàn)示于圖 4，其中，實(shí)際污泥與消化污泥產(chǎn)氣曲線(xiàn)均以3組平行實(shí)驗數據求平均值繪制而成.

 圖 3 總產(chǎn)氣量趨勢圖

　　圖 3顯示，未投加基質(zhì)——木聚糖的兩個(gè)空白樣之氣體產(chǎn)量隨時(shí)間推移逐漸減少，直至第10周期(60 d)時(shí)為零，說(shuō)明空白樣因無(wú)外加碳源而只能進(jìn)行內源呼吸，直至內源碳源消耗殆盡.反觀(guān)投加木聚糖血清瓶氣體產(chǎn)量，先升后降，先后出現兩個(gè)谷峰和谷底.這一產(chǎn)氣量變化趨勢說(shuō)明，血清瓶中的木聚糖已被降解，即，兩種種泥中均存在著(zhù)不同含量可降解木聚糖的厭氧微生物.

 圖 4 CH₄產(chǎn)氣量趨勢圖

　　圖 3、圖 4產(chǎn)氣量出現的連續谷峰、谷底圖形暗示，在實(shí)驗的伊始，可能因降解木聚糖之細菌較少而造成木聚糖少量降解與細菌內源呼吸并行的狀態(tài)，即，此時(shí)觀(guān)測到的產(chǎn)氣量為兩者的疊加(以?xún)仍春粑�產(chǎn)氣量為主)，開(kāi)始出現第一個(gè)谷峰.第2周期后，內源呼吸作用開(kāi)始減弱，由此產(chǎn)生的氣量隨之減少，使得總產(chǎn)氣量隨之減少，以至于出現第一個(gè)谷底.從第3周期開(kāi)始，血清瓶中富集培養的降解木聚糖細菌開(kāi)始增多，使得木聚糖降解效果明顯增強，由此通過(guò)水解產(chǎn)生的單糖并形成甲烷的份額出現跳躍式上升，于第5、6周間出現第2個(gè)谷峰.木聚糖降解率提高也意味著(zhù)被水解成的單糖轉化為揮發(fā)性有機酸(VFAs)的程度得以增強，導致pH開(kāi)始下降，最終抑制了產(chǎn)甲烷細菌的活性，使產(chǎn)氣量不斷下降，以至于出現第2個(gè)谷底.

　　實(shí)際污泥與消化污泥產(chǎn)氣量高低略微不同的曲線(xiàn)表明，兩種種泥中均存在著(zhù)可降解木聚糖的微生物，但消化種泥中因厭氧培養而含量較高.因此，在隨后投加富集木聚糖富集微生物實(shí)驗中選擇了厭氧消化培養種泥.

　　3.2 木聚糖酶活性

　　從第6周期開(kāi)始，每周期開(kāi)始檢測并計算系統中木聚糖酶活性狀況，結果如圖 5所示.與圖 3繪制數據處理相同，實(shí)際污泥與消化污泥酶活性曲線(xiàn)均以3組平行實(shí)驗數據求平均值繪制而成，與圖 3對應一致.

 圖 5 木聚糖酶活性趨勢圖

　　圖 5顯示，兩組空白對照實(shí)驗中酶活性均保證不變并維持在一很低數值，說(shuō)明因空白樣中未投加木聚糖而使得其中可降解木聚糖微生物未能得到富集培養.相比之下，投加木聚糖的6組血清瓶中酶活性均顯示出趨勢一致的上升勢頭，說(shuō)明其中已成功培養并富集到相當數量可降解木聚糖的微生物，這與圖 3顯示的產(chǎn)氣量變化曲線(xiàn)變化趨勢一致.實(shí)際污泥與消化污泥酶活性平均值顯示均是先穩定增長(cháng)，至第8周期時(shí)趨于平穩，說(shuō)明了在整個(gè)富集培養過(guò)程中，可降解木聚糖微生物數量持續增長(cháng)至穩定.此外，消化污泥酶活性略高于實(shí)際污泥亦說(shuō)明，消化種泥中可降解木聚糖微生物數量略多，與圖 3產(chǎn)氣量結果推測一致.

　　3.3 微生物鑒定

　　3.3.1 細菌形態(tài)觀(guān)察

　　對兩種不同種泥富集獲得 的污泥和上清液各取1 mL并稀釋10倍后，取一滴 至載玻片上;風(fēng)干后用結晶紫染色1 min，并用蒸餾水洗凈后再次風(fēng)干;置載玻片于顯微鏡下觀(guān)察，觀(guān)察到如圖 6所示的結果.

　　圖 6顯示，兩種種泥富集培養獲得木聚糖降解細菌均為游離分散狀態(tài).其中，實(shí)際污泥富集后的細菌形態(tài)主要為桿狀和球狀，即，細菌主要以球狀細菌及桿狀細菌為主;消化污泥中的細菌形態(tài)為球狀、桿狀還有少量絲狀，即，細菌除球狀細菌及桿狀細菌外，也有少量絲狀細菌.由細菌鑒定知識可知，從形態(tài)學(xué)角度只能確定出富集獲得微生物為梭狀芽孢桿菌、芽孢桿菌和擬桿菌種的一種或多種，但并不能確切甄別出到底屬于哪一種或哪幾種.因此，只有分子生物學(xué)方法才能具體鑒定出菌種的類(lèi)別.

 圖 6 富集污泥中細菌形態(tài)(a.實(shí)際污泥；b. 消化污泥)

　　3.3.2 FISH實(shí)驗

　　富集獲得細菌菌種經(jīng)FISH鑒定后結果示于圖 7.圖 7顯示，兩張圖片中均有綠色出現，說(shuō)明富集獲得微生物中梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬同時(shí)存在.此外，圖 7a顯示出較圖 7b多的綠色面積，說(shuō)明富集獲得的微生物中以梭狀芽孢桿菌為主.由此可以斷定，富集獲得的微生物以梭狀芽孢桿菌為主，同時(shí)含有芽孢桿菌，為兩者的混合物.

 圖 7 FISH圖像(圖中CY3標記探針CST440和BCE182為綠色，用于檢測降解木聚糖微生物；CY5標記的探針為紅色，用于標記所有微生物)

　　3.4 微生物活性比例(LIVE/DEAD)

　　LIVE/DEAD染色實(shí)驗顯微圖像結果示于圖 8.根據統計學(xué)分析可以得出，富集獲得的微生物活性分別為：實(shí)際污泥83.6%、消化污泥92.8%.這樣的實(shí)驗結果足以說(shuō)明，實(shí)際污泥與消化污泥中細菌存活率均保持在很高水平，具有很高活性.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

 圖 8 LIVE/DEAD顯微圖像(a. 實(shí)際污泥；b.消化污泥; 圖中綠色為活菌；紅色為死菌；黃色為兩種熒光顏色疊加效果)

　　4 結論

　　通過(guò)兩種不同污泥投加同一底物——木聚糖進(jìn)行可降解木聚糖微生物富集培養實(shí)驗得知，無(wú)論是從污水處理廠(chǎng)剩余污泥中還是實(shí)驗室發(fā)酵罐厭氧培養污泥中均可富集到相當數量(前者略低于后者)的可降解木聚糖微生物，說(shuō)明污泥中至少存在著(zhù)可厭氧降解纖維素和半纖維素的微生物.通過(guò)FISH與LIVE/DEAD實(shí)驗可知，富集獲得的木聚糖降解細菌處于游離分散狀態(tài)，為梭狀芽孢桿菌屬和芽孢桿菌屬的混合物，以梭狀芽孢桿菌為主.從兩種不同種泥中獲得的富集微生物活性分別為：實(shí)際污泥83.6%，消化污泥92.8%，說(shuō)明富集出的微生物具有很高的細菌活性.