1 引言
近年來(lái)，由于化纖織物的發(fā)展和印染后整理技術(shù)的進(jìn)步，使大量PVA漿料、新型助劑等難生化降解的有機物進(jìn)入印染廢水，這給生化處理增加了難度.而水解酸化的目的是針對印染廢水中這類(lèi)可生化性很差的一些高分子物質(zhì)，期望它們在厭氧段轉化為小分子物質(zhì)，從而改善廢水的可生化性，為后續處理創(chuàng )造條件.
UASB反應器(Up-flow Anaerobic Sludge Blanket)作為第二代廢水厭氧生物處理的典型工藝，具有結構緊湊、處理能力大(有機負荷高)、無(wú)機械攪拌裝置、處理效果好及占地小等優(yōu)點(diǎn)，與傳統的厭氧生物處理工藝相比，實(shí)現了水力停留時(shí)間(HRT)與污泥停留時(shí)間(SRT)的有效分離，是目前研究較多、應用日趨廣泛的新型廢水厭氧處理設備.
為此，某印染廢水處理廠(chǎng)采用UASB作為水解酸化池，穩定運行后發(fā)現其不僅具有傳統水解酸化的作用，廢水通過(guò)UASB還具有脫氮效能且排泥量很少，2012年每噸水的污泥產(chǎn)量?jì)H為376 g(含水率80%)，大大小于奚旦立等研究發(fā)現的4000 g · t-1(含水率80%)的平均水平.為闡明該UASB如何脫氮并實(shí)現低污泥產(chǎn)量，本研究利用454高通量測序技術(shù)對UASB中水解酸化污泥進(jìn)行微生物的菌群結構分析，以期從微觀(guān)方面解釋這種現象并為以后此類(lèi)廢水的處理提供參考.
2 材料與方法
2.1 工藝概況
江蘇某工業(yè)園區污水處理廠(chǎng)以處理印染廢水為主，約占總處理水量90%以上，處理水量約為12000 m3 · d-1左右，采用“UASB +好氧池+接觸氧化池”為主體的二級生化處理工藝.經(jīng)多年的實(shí)際運行，大量監測數據表明，該工藝處理效果良好，出水水質(zhì)達到《城鎮污水處理廠(chǎng)污染物排放標準》(GB18918—2002)一級A標準.2010—2012年污水處理廠(chǎng)進(jìn)出水水質(zhì)情況如表 1所示，工藝流程見(jiàn)圖 1.
表1 2010—2012年污水處理廠(chǎng)進(jìn)出水水質(zhì)情況
圖 1 工藝流程圖
2.2 水解酸化
通過(guò)投加稀硫酸調節廢水的pH值，使后續生化反應池內的微生物在正常環(huán)境下生存，以保證銜接工序高效穩定地運行.UASB可降解部分有機污染物、截流與消化回流剩余污泥和SS，減小后續處理的有機負荷.
UASB反應池的外形尺寸為16 m×16 m×14 m(長(cháng)×寬×高)，為鋼筋混凝土結構，共2座，有效水深8.5 m，三相分離區3.0 m，布水區1.5 m，超高0.5 m，水力停留時(shí)間8.0 h.系統穩定運行后，廢水通過(guò)UASB反應池，其污染物的去除率如表 2所示.
表2 UASB中污染物去除率
2.3 實(shí)驗方法
污泥樣品取自于現場(chǎng)穩定運行的UASB中，用無(wú)菌采樣袋裝盛并密封帶回實(shí)驗室，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR并委托上海歐易公司采用454高通量測序技術(shù)對污泥樣品的微生物群落進(jìn)行分析，實(shí)驗流程如下.
2.3.1 DNA提取
使用OMEGA 公司的E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性.
2.3.2 PCR擴增
按指定測序區域，合成帶有5′454 A、B接頭-特異引物3′的融合引物，PCR采用TransGen TransStart Fastpfu DNA Polymerase AP221-02，PCR儀為ABI GeneAmp 9700 型;每個(gè)樣品3個(gè)重復，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫;2%瓊脂糖電泳檢測.
2.3.3 熒光定量
參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM -ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個(gè)樣品的測序量要求，進(jìn)行相應比例的混合. emPCR和Roche Genome Sequencer FLX +上機測序所用試劑分別為Roche GS FLX Titanium emPCR Kits(Lib-L)和Roche GS FLX+ Sequencing Method Manual_XLR70 kit.
2.3.4 生物信息學(xué)分析
去除序列末端的后引物和接頭序列、多堿基N、poly A/T尾巴及低質(zhì)量堿基;去除所得序列的barcode標簽序列、前引物序列;丟棄長(cháng)度短于200 bp、模糊堿基數>0、序列平均質(zhì)量低于25的序列;提取非重復序列，與Silva數據庫(http://www.arb-silva.de/)中已比對的(16S/18S，SSU)核糖體序列數據進(jìn)行比對，去雜后生成分類(lèi)操作單元;采用Mothur(http://www.mothur.org/wiki/Classify.seqs)軟件將OTU中全部序列與Silva數據庫進(jìn)行比對，找出最相近且可信度達80%以上的種屬信息.為了獲得每個(gè) OTU 的分類(lèi)學(xué)信息，將 97%相似水平下每個(gè) OTU 中的所有序列進(jìn)行一致性分析，找出同一個(gè) OTU 中的不同序列的最近祖先的種屬信息作為該 OTU 的種屬信息.
3 結果與分析
3.1 微生物群落的多樣性分析
3.1.1 微生物的豐度和多樣性指數
通過(guò)對Chao指數(http://www.mothur.org/wiki/Chao)和Ace指數(http://www.mothur.org/wiki/Ace)的計算可以統計出UASB中微生物群落的豐度估計，結果見(jiàn)表 3.通過(guò)對Shannon指數(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)和Simpson指數(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)指數的計算可以統計出UASB中的微生物群落的多樣性估計，結果見(jiàn)表 4.
式中，Schao1為估計的OTU數，即Chao指數;Sobs為實(shí)際觀(guān)測到的OTU數;N1為只含有一條序列的OTU數目;N2為只含有兩條序列的OTU數目;SACE 為ACE指數;Srare為含有少于10條(包含10條)序列的OUT數目;Sabund為含有多于10條序列的OUT數目;abund為“優(yōu)勢”OUT的閥值，默認為10;Ni為含有i條序列的OUT數目;Dsimpson為Simpson指數;Hshannon 為Shannon指數;N為所有的序列數.
表3 樣品的豐度估計量
表4 樣品的多樣性估計量
Boon等研究發(fā)現，生活廢水、造紙廢水、印染廢水的菌群Shannon指數分別為2.70、2.68、 2.45.Miura等對城市污水的細菌群落結構進(jìn)行了研究，其Shannon指數在3.25~4.00之間.因此，從表 3和表 4可見(jiàn)，該印染廢水處理系統中細菌具有較高多樣性，同時(shí)，根據生態(tài)學(xué)中的多樣性導致穩定性原理，UASB反應器中的微生物菌種呈多樣性分布有利于穩定產(chǎn)酸，并為后續微生物提供豐富的有效碳源.
3.1.2 Good′s Coverage指數和稀釋性曲線(xiàn)
通過(guò)Good′s Coverage指數(http://www.mothur.org/wiki/Coverage)的計算(公式(9))結果可以看出，樣品的Good′s Coverage指數都較高(表 5)，表示樣品中序列被測出的概率較高.從圖 2可以看出，樣品的稀釋性曲線(xiàn)已經(jīng)漸漸趨向較平坦，證明此次測序的數據量是合理的，繼續測序不會(huì )再產(chǎn)生較多新的OTU.
式中，N1 為只含有一條序列的OUT數目，N為抽樣中出現的總序列數目.
表5 Good′s Coverage指數計算結果
圖 2 樣品稀釋性曲線(xiàn)
3.2 測序結果
樣品有效序列和優(yōu)化序列分別為11707和8491，通過(guò)分類(lèi)學(xué)分析，UASB中微生物共有435種，在門(mén)的分布比例主要為變形菌門(mén)30.36%，擬桿菌門(mén)25.59%、綠彎菌門(mén)19.34%、厚壁菌門(mén)12.35%、互養菌門(mén)6.46%、螺旋體門(mén)1.58%和浮霉菌門(mén)1.15%等.
通過(guò)454高通量測序，在屬的水平上的優(yōu)勢菌群組成鑒定結果如表 6所示.可以看出，在UASB反應池的優(yōu)勢菌屬中并未發(fā)現含有產(chǎn)甲烷菌，說(shuō)明厭氧消化很好地停留在了水解酸化階段.
表6 優(yōu)勢菌屬及其比例
任南琪等研究發(fā)現，脫硫橄欖樣菌屬(Desulfobacula)屬于δ變形菌綱(Deltaproteobacteria)的脫硫桿菌科(Desulfobacteraceae)，可氧化各種芳香族化合物(包括芳香族硫氫甲苯)為CO2，它在缺氧的環(huán)境中可以利用硫酸鹽和硫作為電子受體并以有機化合物作為電子供體，屬于完全氧化型SRB(Sulfate-reducing bacteria)，可以通過(guò)TCA途徑或乙酰輔酶A途徑將乙酸反向氧化至CO2和H2O.桿狀脫硫菌屬(Desulforhabdus)也是屬于δ變形桿菌綱(Deltaproteobacteria)的硫酸鹽還原菌，可利用脂肪酸并將其完全氧化成CO2.
Levilinea和長(cháng)繩菌屬(Longilinea)同屬于綠彎菌門(mén)的厭氧繩菌綱(Anaerolineae)，目前對它們的研究較少.曹新塏等對工業(yè)廢水中的萘進(jìn)行高效生物處理時(shí)發(fā)現，微生物群落中含有Levilinea和Longilinea，證明此兩種屬菌類(lèi)對于染料中的萘有一定的去除作用.Thauera屬細菌是β變形菌綱(Betaproteobacteria)下的一類(lèi)革蘭氏陰性細菌，大都為桿狀且具有反硝化能力.廣泛存在于各種類(lèi)型的廢水處理裝置中并具有多種芳香族污染物降解能力的重要功能類(lèi)群且已知的Thauera屬細菌則都是反硝化菌.
Paludibacter屬于擬桿菌門(mén)的紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)，為中溫厭氧型且能發(fā)酵多種單糖和二糖產(chǎn)丙酸、乙酸和少量丁酸.Tepidimicrobium屬于梭菌綱(Clostridia)的梭菌科(Clostridiaceae)，Slobodkin等發(fā)現它中度嗜熱，屬于厭氧細菌;Phitsuwan等發(fā)現它能夠分解纖維素和木聚糖.類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacillus)的細胞呈桿狀，能從各種糖上產(chǎn)酸，有的種還能夠分解不同的多糖.李欣等某污水處理廠(chǎng)活性污泥采用雙層平板基內培養法篩選得到一株兼性產(chǎn)淀粉酶菌株，經(jīng)過(guò)鑒定為類(lèi)芽胞桿菌屬.
梭菌屬(Clostridium)屬于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)，Rhee等將剩余污泥用厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的梭菌屬(Clostridium)進(jìn)行發(fā)酵，可以實(shí)現污泥減量化和揮發(fā)酸的生產(chǎn)，是UASB中起到產(chǎn)酸和污泥減量作用的主要菌種之一.
從表 2中可以看出，印染廢水通過(guò)UASB反應池，B/C可以從進(jìn)水時(shí)的0.30提高到0.42，SS和色度去除率分別達到70%和76%，并且在此印染廢水處理工藝中，廢水通過(guò)UASB反應池，NH+4-N與TN也有33%和40%左右的去除效率.這是因為在前端投加了稀H2SO4調節pH，UASB中硫酸鹽抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長(cháng)，使整個(gè)反應器更好地停留在了水解酸化階段，脫硫橄欖樣菌屬(Desulfobacula)和桿狀脫硫菌屬(Desulforhabdus)能夠氧化廢水中的乙酸、芳香族等有機物為CO2并將SO2-4還原成S2-;Paludibacter、 Tepidimicrobium、Paenibacillus能夠分解廢水中的多糖等物質(zhì)，Levilinea和長(cháng)繩菌屬(Longilinea)能夠去除染料中的萘，Thauera屬能夠去除印染廢水中所含的少量芳香烴污染物.梭菌屬(Clostridium)可能是此印染廢水具有低污泥產(chǎn)量的主要原因.
不可忽視的是，氨氮在通過(guò)UASB后有一定程度的去除，在門(mén)的水平下浮霉菌門(mén)占1.15%，且厭氧的浮霉菌門(mén)大部分都為厭氧氨氧化菌，由此可以推測出是通過(guò)厭氧氨氧化作用來(lái)去除的.但進(jìn)水中硝酸鹽與亞硝酸鹽的含量很低，且通過(guò)高通量測序在屬的水平上并未發(fā)現目前已知的幾種以亞硝酸鹽為電子受體的厭氧氨氧化菌，如C and idatus Brocadia、C and idatus Kuenenia、C and idatus Scalindua、C and idatus Jettenia等.因此，可能發(fā)生的是硫酸鹽型厭氧氨氧化反應，能夠以氨為電子供體，以硫酸鹽為電子受體，將兩種基質(zhì)轉化為氮氣和單質(zhì)硫.雖然目前對硫酸鹽型厭氧氨氧化的研究較少，并不能確定到種屬的水平上，但我們可以推測在進(jìn)水無(wú)硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的情況下，稀硫酸的存在可以發(fā)生硫酸鹽型厭氧氨氧化從而去除進(jìn)水中的部分氨氮.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結論
1)本研究采用454高通量測序技術(shù)，對運行期間的UASB水解酸化污泥中微生物菌群進(jìn)行分析，從而得知在UASB反應池中的優(yōu)勢微生物種屬，通過(guò)菌群鑒定發(fā)現：Desulfobacula、Levilinea、Longilinea、C and idatus Tammella、Paludibacter、Thauera、Tepidimicrobium、Desulforhabdus、Paenibacillus、Clostridium是主要的優(yōu)勢菌屬，梭菌屬(Clostridium)主要起到污泥減量和產(chǎn)酸的作用，氨氮降低的原因則與硫酸鹽型厭氧氨氧化作用有關(guān).
2)通過(guò)前端投加稀H2SO4來(lái)調節進(jìn)水的pH，不僅可以在厭氧消化階段抑制產(chǎn)甲烷菌使其更好地停留在水解酸化階段，且對含有氨氮而不含硝態(tài)氮與亞硝態(tài)氮的廢水可以通過(guò)硫酸鹽型厭氧氨氧化反應來(lái)去除氨氮，這對此類(lèi)廢水的處理具有一定的參考價(jià)值.
3)通過(guò)Shannon等指數的計算可以看出，該UASB反應器較其他廢水處理系統的微生物菌群多樣性較高，有利于穩定產(chǎn)酸，并為后續微生物提供豐富的有效碳源.
