污水中新精神活性物質(zhì)分析方法優(yōu)化及驗證

　　新精神活性物質(zhì)(new psychoactive substances, NPS)是指為了逃避法律對傳統毒品的管制或提高毒品的藥理活性, 對已有毒品的化學(xué)結構加以修飾, 制成的具有類(lèi)似列管毒品麻醉、興奮或致幻作用的藥.與傳統毒品相比, NPS種類(lèi)更為繁多、更新速度更快.截至2015年底, 已發(fā)現NPS的種類(lèi)從2009年的166種增長(cháng)到了2015年的644種, 遠遠超過(guò)國際管制的常規違禁藥物總數(234種).目前發(fā)現的NPS主要包括以下七類(lèi)：合成卡西酮類(lèi)、哌嗪類(lèi)、苯乙胺類(lèi)、合成大麻素類(lèi)、植物源類(lèi)物質(zhì)(如卡痛葉和鼠尾草等)、氯胺酮和其他物質(zhì)(包括氨基茚滿(mǎn)、色胺和苯環(huán)己哌啶型物質(zhì)等).隨著(zhù)NPS濫用的增多以及其危害性逐漸被認識, 部分NPS開(kāi)始被一些國家列為管制藥物.我國也已將部分卡西酮類(lèi)和哌嗪類(lèi)物質(zhì)列入管制藥品.

　　與人們服用的常規藥物類(lèi)似, NPS被濫用后, 經(jīng)人體新陳代謝所生成的代謝產(chǎn)物和未被代謝的原藥隨尿液進(jìn)入生活污水, 從而匯入污水處理廠(chǎng).經(jīng)污水廠(chǎng)處理后, 未被去除的NPS被排入自然水體.因此, 污水處理廠(chǎng)排放被認為是環(huán)境中NPS的主要來(lái)源之一. NPS具有較強的生物活性, 其大量被排入到環(huán)境中, 不僅對環(huán)境造成了污染, 而且帶來(lái)了潛在的健康風(fēng)險.因此, NPS也被環(huán)境學(xué)家列為一類(lèi)新型污染物.

　　基于NPS帶來(lái)的社會(huì )問(wèn)題和環(huán)境問(wèn)題, 對其進(jìn)行定性定量分析并估算其濫用量對于毒品管控和健康風(fēng)險評價(jià)具有重要意義.然而, 傳統方法如社會(huì )調查不能準確、客觀(guān)地估算NPS的濫用量, 且操作成本較高、不確定性較大.近年來(lái), 一種叫污水流行病學(xué)的方法(wastewater-based epidemiology)被提出并用于估算毒品的濫用量.其原理是通過(guò)測定污水處理廠(chǎng)進(jìn)水中毒品及其代謝物濃度, 通過(guò)污水廠(chǎng)日處理量、服務(wù)區人口及毒品排泄率等參數反算毒品濫用量.該方法所得數據更為客觀(guān), 具有時(shí)效性高、便于不同區域橫向比較等優(yōu)點(diǎn), 且已在估算傳統毒品濫用量等方面發(fā)揮了巨大作用.近年來(lái), 已有研究團隊應用該方法分析測定了污水中卡西酮類(lèi)和哌嗪類(lèi)NPS, 認為該方法具有預警NPS濫用的潛能, 并可用于評價(jià)禁毒措施的績(jì)效性.但污水中其它常見(jiàn)NPS[如4-甲氧基甲基苯丙胺、2-甲基氨基-1-(3, 4-亞甲二氧苯基)-1-丙酮、2, 5-二甲氧基-4-苯乙胺等]的分析方法仍不完善.

　　為進(jìn)一步完善污水中常見(jiàn)NPS的分析方法并提高分析測定效率, 經(jīng)調查, 本研究選取國內濫用較多的11種NPS作為目標化合物, 建立污水中目標物前處理及分析測定方法, 并通過(guò)對北京市主城區11家污水處理廠(chǎng)進(jìn)、出水樣品的分析進(jìn)行方法驗證, 以期為今后開(kāi)展NPS的污水流行病學(xué)研究及健康風(fēng)險評價(jià)奠定基礎.

　　1 材料與方法1.1 材料

　　11種NPS標準品(100 μg·mL-1于甲醇, 純度>99%)以及各自相應的氘代內標儲備液(10 μg·mL-1于甲醇, 純度>99%)購于美國Cerilliant公司, 包括氯胺酮(KET)、甲卡西酮(MC)、麻黃堿(EPH)、4-甲氧基甲基苯丙胺(PMMA)、2-甲基氨基-1-(3, 4-亞甲二氧苯基)-1-丙酮(MDMC)、2, 5-二甲氧基-4-苯乙胺(2C-I)、甲氧麻黃酮(MEPH)、卡西酮(CA)、1-芐基哌嗪(BZP)、1-(3-三氟甲基苯基)哌嗪(TFMPP)和1-(3-氯苯基)哌嗪(mCPP), 以及KET-D4、MC-D3、EPH-D3、MEPH-D3、MDMC-D3、2C-I-13C-D3、CA-D5、BZP-D7、TFMPP-D4和mCPP-D8.

　　主要儀器和耗材：12位固相萃取裝置(德國CNW公司), Oasis MCX和Oasis HLB固相萃取柱(均為60 mg 3 mL, 美國Waters公司), 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(色譜儀：日本島津UFLCXR-LC, 質(zhì)譜儀：美國AB Sciex API-4000)等.

　　1.2 質(zhì)譜和液相色譜條件的優(yōu)化

　　根據目標物的性質(zhì)選擇離子源和離子化模式.根據目標物及其氘代化合物的分子量設置掃描的荷質(zhì)比m/z范圍, 尋找目標物母離子.利用儀器自動(dòng)優(yōu)化去簇電壓(DP)得到最大母離子響應.手動(dòng)調節和優(yōu)化碰撞能量(CE), 得到最佳響應的子離子對.將每種目標物豐度最大的離子對作為定量離子, 另一離子對作為定性離子.

　　采用液相色譜柱Phenomenex Gemini C18柱(100 mm×2 mm, 3 μm), 優(yōu)化流動(dòng)相pH值和所含鹽類(lèi)、洗脫梯度等條件, 以獲得目標物的理想峰型和高分離度.

　　1.3 樣品前處理方法

　　采用固相萃取的方法對污水樣品進(jìn)行濃縮和凈化, 使用Oasis MCX作為SPE柱的樣品前處理方法如圖 1.使用Oasis HLB作為SPE柱的樣品前處理方法與上述基本相同, 不同之處在于②Oasis HLB柱活化：依次加入6 mL甲醇和6 mL超純水, 流速1~2 mL·min-1; ⑦洗脫：用8 mL甲醇洗脫干燥的HLB柱, 流速1~2 mL·min-1.

　　圖 1

 圖 1 使用Oasis MCX作為SPE柱的樣品前處理方法

　　1.4 質(zhì)量控制1.4.1 回收率

　　分別取20、100和200 μL的200 ng·mL-1混標注入50 mL pH=2的超純水中配成樣品溶液, 并設置一組流程空白, 同時(shí)進(jìn)行前處理和測定.根據流程空白和加標樣品的測定數據及實(shí)際加標濃度計算得到11種NPS在不同濃度梯度下各自的回收率.

　　1.4.2 基質(zhì)效應

　　選取BJ-6污水廠(chǎng)進(jìn)水水樣作為基質(zhì)效應的供試水樣.對該水樣進(jìn)行前處理, 在上機前分別向已處理的樣品中加入20、100和200 μL的200 ng·mL-1混標和100 μL的200 ng·mL-1內標, 得到濃度為10、50和100 ng·mL-1的樣品和空白樣品(僅加入內標).通過(guò)比較各目標物在不同濃度梯度下加標水樣與空白水樣的檢測濃度之差和其在相應濃度標準樣品中的檢測濃度, 評價(jià)基質(zhì)對各目標物響應值的抑制和促進(jìn)作用.

　　1.4.3 檢出限和定量限

　　將低濃度目標物混合標準溶液上機測定, 儀器檢出限(ILOD)和儀器定量限(ILOQ)分別以3倍信噪比(3S/N)和10倍信噪比(10S/N)確定.方法檢出限(MLOD)和方法定量限(MLOQ)分別通過(guò)以下公式計算得到

　　式中, 400 μL為上機濃縮液的體積, 50 mL為前處理所取污水樣的體積.

　　1.4.4 標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性及范圍

　　配制含甲醇體積20%、濃度范圍為0.1~200 ng·mL-1的不同濃度梯度的標準工作溶液, 盡可能保證濃度范圍覆蓋實(shí)際污水樣品中的水平.

　　1.4.5 精密度

　　分別對同一標準樣品連續多次測定(n=3)和多天重復測定(n=3)來(lái)衡量?jì)x器的日內精密度與日間精密度, 對同一水樣連續前處理(n=3)和多天重復前處理(n=3)來(lái)衡量前處理方法和實(shí)驗操作的日內精密度與日間精密度, 結果均用相對標準偏差(RSD)表示.

　　2 結果與討論2.1 優(yōu)化后的液相色譜條件

　　本研究采用Phenomenex Gemini C18(100 mm×2 mm, 3 μm)液相色譜柱對目標化合物進(jìn)行分離.優(yōu)化后的流動(dòng)相為：0.12%甲酸30 mmol·L-1, 甲酸銨超純水溶液(A相); 甲醇(B相).洗脫梯度如表 1所示, 流速為0.3 mL·min-1, 柱溫為35℃, 進(jìn)樣量為5 μL.優(yōu)化后的液相色譜條件不僅提高了儀器對目標化合物的靈敏度, 而且明顯縮短了分析周期, 提高了分析效率.

　　2.2 優(yōu)化后的質(zhì)譜條件

　　本研究采用多反應監控模式(MRM)對所有目標化合物進(jìn)行檢測.離子源為電噴霧離子源(ESI), 離子源電壓(IS)為3 500 V, 離子源溫度(TEM)為525℃, 離子化模式為ESI(+); 碰撞池氣壓(CAD)為10 psi(69 kPa), 氣簾氣壓力(CUR)為20 psi(138 kPa), 干燥氣(GS1)與輔助氣(GS2)壓力均為40 psi(276 kPa).每種目標化合物及其相應內標的母離子和定量、定性離子的核質(zhì)比(m/z)、去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)及保留時(shí)間(RT)等質(zhì)譜參數列于表 2中.

　　表 2 目標物C18-UPLC-MS/MS的質(zhì)譜參數

　　圖 2為優(yōu)化后11種NPS的色譜圖.由表 2和圖 2可知, 不同目標化合物的保留時(shí)間均有較大差異, 說(shuō)明優(yōu)化后的C18-UPLC-MS/MS條件能夠對所選目標物進(jìn)行有效分離.

　　圖 2

 圖 2 11種NPS的C18-UPLC-MS/MS色譜圖

　　2.3 優(yōu)化后的樣品前處理條件2.3.1 SPE柱和樣品pH值

　　Oasis HLB和Oasis MCX是環(huán)境水樣前處理中廣泛使用的兩種SPE柱.本研究分別考察兩種SPE柱在不同pH條件下加載樣品對目標NPS回收率的影響. Oasis HLB柱的加載條件為pH=2, 7, 11; Oasis MCX柱的加載條件為pH=2, 7.按1.3節中所述方法進(jìn)行前處理.

　　由表 3可知, HLB柱在酸性、中性和弱堿性條件下均無(wú)法對CA進(jìn)行富集. MC、PMMA、2C-I和MEPH的回收率在樣品pH值為2、7、11時(shí)存在顯著(zhù)差異, 且回收率存在低于80%和高于120%的情況.可見(jiàn), 使用Oasis HLB柱對樣品進(jìn)行富集時(shí), 樣品pH值對目標物的回收率有顯著(zhù)影響, 且不同NPS的最佳pH值存在較大差異.因此Oasis HLB柱不適宜用于測定污水中常見(jiàn)NPS的前處理過(guò)程.而使用Oasis MCX柱時(shí), 在樣品pH值為2和7的條件下, 每種NPS均被有效富集, 且目標物的回收率基本在80%~120%之間, 因此Oasis MCX柱更適合用于水樣的前處理.綜合比較使用Oasis MCX柱時(shí)的兩種樣品pH值條件, pH=2時(shí)各種物質(zhì)的回收率更接近于100%, 因此本研究認為在pH值為2的條件下使用Oasis MCX柱更適合于含多種NPS水樣的前處理與同步測定.在后續實(shí)驗及今后實(shí)際污水樣品前處理時(shí), 統一選用Oasis MCX柱并將樣品pH值調至2.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

 

　　表 3 不同SPE柱和水樣pH值條件下目標物的回收率比較/%

　　本研究對于SPE柱選擇的實(shí)驗結果與文獻[23~25]的研究結論具有一致性, 即對于CA、MC、MEPH等NPS在內的毒品, 用Oasis HLB柱前處理的回收率和基質(zhì)效應均差于Oasis MCX柱或不能達到實(shí)驗要求.這可能是由于Oasis MCX柱的基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物, 與Oasis HLB吸附劑相比, 對堿性化合物具有更高的選擇性和靈敏度.而本研究所監測的NPS均具有含氮的堿性基團, 因此Oasis MCX柱能夠更有效滿(mǎn)足富集要求.

　　2.3.2 淋洗步驟

　　當目標物及其內標受基質(zhì)干擾嚴重或者基質(zhì)對兩者的影響程度不一致時(shí), 為保證目標物準確定量, 有必要在污水樣品加載之后增加對SPE柱的淋洗步驟.本研究在Oasis MCX固相萃取方法的基礎上, 在樣品加載結束之后, 將淋洗步驟分別改為無(wú)淋洗、2 mL pH=2的超純水淋洗和2 mL甲醇淋洗這3組對照實(shí)驗, 研究淋洗步驟對目標物回收率的影響.

　　表 4中的數據顯示, 無(wú)淋洗和僅用2 mL pH=2的超純水淋洗時(shí), KET和MEPH的回收率降至80%以下, CA的回收率降至不足50%;而僅用2 mL甲醇淋洗時(shí)2C-I的回收率降至了80%以下, CA的回收率降至不足55%.這表明樣品加載后先用2 mL pH=2的超純水、再用2 mL甲醇淋洗的兩個(gè)步驟均不可或缺.

　　表 4 不同淋洗和復溶條件下目標物的回收率比較/%

　　2.3.3 復溶溶劑的量與復溶步驟

　　為研究復溶條件的改變對目標物回收率的影響, 本研究設置兩組對照實(shí)驗, 分別為：①200 μL 20%甲醇水溶液復溶氮吹殘留物1 min, ②先用80 μL甲醇復溶30 s, 再加入320 μL超純水復溶30 s.

　　由表 4中不同復溶條件下的回收率數據可知, 改變復溶溶劑的量和步驟后, PMMA的回收率均超過(guò)120%, 遠超可接受范圍.因此本研究認為, 在現有的固相萃取和C18-UPLC-MS/MS條件下, 采用400 μL 20%甲醇水溶液復溶氮吹殘留物1 min最為合適.

　　2.4 對已優(yōu)化方法的評價(jià)2.4.1 回收率和基質(zhì)效應

　　如表 5所示, 在基本覆蓋了實(shí)際污水中NPS檢出濃度的各種條件下, 每種目標物的回收率基本上均在80%~120%之間, 基質(zhì)效應基本上均在-20%~20%之間.結果總體表明, 本研究采用上述方法進(jìn)行前處理和樣品測定是可行的.

　　表 5 SPE-C18-UPLC-MS/MS優(yōu)化方法的回收率和基質(zhì)效應/%

　　2.4.2 檢出限、定量限、標準曲線(xiàn)線(xiàn)性及范圍

　　表 6中的結果顯示, 各種目標物的LOD和LOQ均很低, 基本滿(mǎn)足實(shí)際污水樣品測定的要求.所有目標物的標準曲線(xiàn)相關(guān)系數均在0.99以上, 且基本所有濃度梯度下的準確度均在85%~115%之間、RSD < 15%, 因此標準曲線(xiàn)可以用于實(shí)際污水中NPS濃度的測定.

　　表 6 SPE-C18-UPLC-MS/MS優(yōu)化方法的檢出限、定量限、標準曲線(xiàn)線(xiàn)性及范圍

　　2.4.3 精密度

　　由表 7可知, 儀器精密度的日內和日間RSD均小于2.5%, 方法精密度的日內和日間RSD均小于8%, 表明儀器的穩定性和實(shí)驗方法的可重復性均符合要求.綜上, 應用本研究中優(yōu)化的SPE前處理方法和C18-UPLC-MS/MS測定方法可以用于污水樣品中的多種NPS同步分析.

　　表 7 儀器精密度和SPE-C18-UPLC-MS/MS優(yōu)化方法的精密度/%

　　3 在實(shí)際污水樣品中的應用

　　本研究于2016年12月對北京市11家污水處理廠(chǎng)的進(jìn)水和出水進(jìn)行了樣品采集, 每家污水廠(chǎng)至少采集2 d以上的樣品, 采用全自動(dòng)水質(zhì)采樣器采集24 h混合水樣.全部11家污水廠(chǎng)日均污水流量約為26萬(wàn)m3, 服務(wù)區總人口達1 096萬(wàn)人, 約占北京市常住人口的50.4%.采用上述優(yōu)化的方法對樣品進(jìn)行前處理和分析測定, 根據進(jìn)水和出水中NPS濃度的差別計算各種目標物的去除率.

　　測定結果顯示, MDMC、MEPH、CA、BZP和mCPP在11家污水廠(chǎng)的進(jìn)水和出水樣品中均未被檢出, 表明這幾種NPS在北京市可能尚無(wú)顯著(zhù)濫用趨勢.其余6種NPS在各污水廠(chǎng)進(jìn)水樣品中的平均濃度如圖 3所示.其中, EPH在進(jìn)水中的濃度水平最高, 濃度范圍在84.23~383.6 ng·L-1; 其次為PMMA, 濃度范圍在9.12~38.48 ng·L-1.值得注意的是, 2C-I雖然僅在BJ-4檢出, 但其在進(jìn)水中的濃度高達92 ng·L-1, 說(shuō)明在該廠(chǎng)服務(wù)區內可能存在2C-I的濫用或者傾倒現象.進(jìn)水中KET、MC和TFMPP的濃度均低于8 ng·L-1.實(shí)際污水樣品測定結果表明, 本研究中的優(yōu)化方法能夠基本滿(mǎn)足污水中的NPS檢測要求.

圖 3 北京市11家污水處理廠(chǎng)進(jìn)水中的NPS濃度

　　這11家污水處理廠(chǎng)對每種目標物的去除率匯總于表 8中.數據顯示, BJ-5、BJ-9和BJ-11中目標物去除率較高, 而其余污水廠(chǎng)對多數目標物的去除率并不理想, 甚至出現了負去除率的情況.造成負去除率的原因可能是污水在污水處理廠(chǎng)中存在長(cháng)達數小時(shí)的停留時(shí)間, 因此進(jìn)、出水中測得的目標物濃度水平無(wú)法準確對應.但總體看來(lái), 這一結果仍表明常見(jiàn)的污水處理工藝對NPS的去除能力有限, 有相當數量的NPS將最終進(jìn)入河流湖海中, 對水環(huán)境生態(tài)形成潛在的威脅.

　　表 8 北京市11家污水處理廠(chǎng)對NPS的去除率/%

　　4 結論

　　(1) 對污水樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化, 表明應選用Oasis MCX柱, 預先調節樣品至pH=2, 樣品加載完后先用2 mL pH=2的超純水淋洗、再用2 mL甲醇淋洗Oasis MCX柱, 抽干后氮吹, 最后用400 μL 20%甲醇水溶液復溶殘留物1 min.

　　(2) 11種NPS的保留時(shí)間、回收率、基質(zhì)效應、檢出限、定量限、精密度等方法評價(jià)指標數據表明, 本研究所確定的SPE前處理方法和C18-UPLC-MS/MS測定方法分離效果好、回收率高、基質(zhì)效應弱、檢出限和定量限低、儀器和方法精密度高, 可用于實(shí)際污水樣品中NPS濃度的檢測.

　　(3) 對北京市11家污水廠(chǎng)進(jìn)、出水樣品中NPS濃度的測定結果顯示, 優(yōu)化的前處理和測定方法能夠基本滿(mǎn)足分析要求. EPH、PMMA和2C-I在進(jìn)水中的濃度較高.多數目標物在污水廠(chǎng)中的去除率并不理想, NPS隨出水進(jìn)入河流等生態(tài)環(huán)境, 產(chǎn)生潛在威脅.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：陳培培)