探究ARGs在廢水處理系統中分布特征和去除情況

　　由于抗生素的廣泛使用乃至濫用, 環(huán)境中殘留的抗生素對自然環(huán)境中的微生物群落產(chǎn)生了選擇性壓力, 使得抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在環(huán)境中持久存在并廣泛傳播.目前ARGs已經(jīng)成為了學(xué)術(shù)界的研究熱點(diǎn), 大量研究表明ARGs廣泛存在于自然水環(huán)境中, 如河流、湖泊乃至海洋.廢水處理系統(wastewater treatment plants, WWTPs)是污染治理體系中的一個(gè)重要環(huán)節, 它匯集了人類(lèi)生活和生產(chǎn)產(chǎn)生的大量生活污水、醫療污水和工業(yè)廢水等, 被認為是自然水環(huán)境中ARGs污染的重要點(diǎn)源, 且促進(jìn)了ARGs的誘導和遷移, 因此, ARGs在不同類(lèi)型的廢水處理系統中的分布特征得到了廣泛關(guān)注.制藥廢水處理系統(pharmaceutical WWTPs, PWWTPs)的進(jìn)水中往往含有高濃度的抗生素及生產(chǎn)原料和中間體, 對生物處理單元的微生物群落形成高強度選擇性壓力, 為ARGs在污水中的持久存在和傳播擴散提供了有利條件, 一些研究證實(shí)制藥廢水處理系統的出水中ARGs的濃度高于市政污水處理系統的出水.制藥廢水處理后往往排入下水道, 與其他污水(主要包括未經(jīng)處理的生活污水和經(jīng)過(guò)處理的其它工業(yè)廢水)合并后再進(jìn)入綜合性廢水處理系統(integrated WWTPs, IWWTPs), 進(jìn)行統一處理后再排入水環(huán)境中.因此, 為了保護自然水生態(tài)安全, ARGs在制藥廢水和綜合性?xún)杉墢U水處理系統中的分布特征和去除效率應給予高度關(guān)注.

　　本研究選取了浙江省某精細化工園區內一家藥業(yè)集團的制藥廢水處理系統和接納該制藥廢水處理系統出水的綜合性廢水處理系統, 沿兩級廢水處理工藝流程采集污水和污泥樣品, 以8類(lèi)共28種ARGs作為目標基因進(jìn)行定性檢測, 并對高頻率檢出的7種ARGs和16S rRNA進(jìn)行定量檢測, 分析ARGs在具有上、下游關(guān)系的兩座廢水處理系統中的分布特征和去除效果, 探索ARGs的去除機制.

　　1 材料與方法1.1 兩級廢水處理系統簡(jiǎn)介

　　選取浙江省某精細化工園區的兩座廢水處理系統為研究對象, 它們分別是藥業(yè)集團的廢水處理系統(PWWTP)和園區綜合性廢水處理系統(IWWTP).該藥業(yè)集團是化學(xué)合成醫藥原料和獸藥原料的生產(chǎn)商, 主導產(chǎn)品為喹諾酮類(lèi)抗菌藥、大環(huán)內酯類(lèi)抗菌藥等抗生素類(lèi)藥物, 其中鹽酸環(huán)丙沙星、恩諾沙星、阿奇霉素、克拉霉素、羅紅霉素等產(chǎn)品在全球市場(chǎng)上占據優(yōu)勢地位.該公司產(chǎn)生的廢水是典型的制藥廢水, 有機污染物濃度高(COD可達5000 mg ·L-1), 水質(zhì)波動(dòng)大, 可生化性較差.該公司的廢水處理系統采用A2O工藝, 設計處理能力為2400 m3 ·d-1, 實(shí)際處理水量約為1000 m3 ·d-1.制藥廢水經(jīng)處理后排入園區下水道, 與園區其它工業(yè)廢水及周邊生活污水混合(工業(yè)廢水和生活污水的比例約為6 :4), 再進(jìn)入園區綜合性廢水處理系統, 該處理系統主體工藝為氧化溝, 分厭氧段、缺氧段和好氧段運行, 設計處理能力為22.5萬(wàn)m3 ·d-1, 目前實(shí)際處理水量約為11.5萬(wàn)m3 ·d-1, 處理后出水排入臨近海域.

　　1.2 樣品采集及預處理

　　本研究的采樣時(shí)間是2015年4月, 兩座廢水處理系統的工藝流程示意圖和采樣點(diǎn)見(jiàn)圖 1, 采樣點(diǎn)具體包括:進(jìn)水(P-Inf和I-Inf)、缺氧池出水(P-Ax和I-Ax)、好氧池出水(P-Ox和I-Ox)和二沉池出水(P-Eff和I-Eff).厭氧池出水由于取樣條件限制未取得.此外, 還采集了二沉池污泥樣品(P-Slu和I-Slu).每個(gè)采樣點(diǎn)采集了1 L水樣, 并存放于預先清洗干凈的無(wú)菌聚乙烯塑料瓶中, 冷藏運輸回實(shí)驗室后置于4℃保存.污泥樣品存放于無(wú)菌的塑料袋中, 冷藏運輸回實(shí)驗室后置于-20℃保存.

　　圖 1

圖 1 兩座廢水處理系統工藝流程和采樣點(diǎn)示意

　　1.3 樣品DNA提取

　　水樣中DNA的收集采用0.22 μm混合纖維素酯濾膜(Millipore, 德國)過(guò)濾截留方法, 污泥樣品則稱(chēng)取約0.2 g轉移到潔凈的收集管中, 隨后二者均使用PowerSoil DNA Isolation Kit (Mo Bio, 美國)試劑盒進(jìn)行DNA提取.提取完成后, 使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 (Thermo Fisher, 美國)對DNA濃度和純度進(jìn)行檢測.

　　1.4 普通PCR檢測

　　本研究選擇了8類(lèi)共27種ARGs進(jìn)行定性檢測, 具體包括7種四環(huán)素類(lèi)ARGs(tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetQ、tetW), 4種磺胺類(lèi)ARGs(sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、sul Ⅲ 、sulA), 3種甲氧芐啶ARGs(dfrA 1 、dfrA 12 、dfrA 13 ), 3種β-內酰胺類(lèi)ARGs(ampC、blaSHV、blaPSE- 1 ), 2種大環(huán)內酯類(lèi)ARGs(ermA、ermB), 3種氯霉素類(lèi)ARGs(cat Ⅰ 、cat Ⅱ 、floR), 2種氨基糖苷類(lèi)ARGs[aac(3)-Ⅱ a、aac(3)-Ⅳ ]和3種萬(wàn)古霉素ARGs(vanA、vanB、vanC).所用的引物序列和片段大小見(jiàn)表 1.本實(shí)驗所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.普通PCR采用25 μL體系, 包含12.5 μL Premix Ex TaqTM Hot Start Version (TaKaRa, 中國); 各1 μL的上、下游引物; 1 μL的DNA模板; 9.5 μL ddH2O. PCR反應程序為: 95℃預變性3 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸60 s, 共35個(gè)循環(huán); 最后于72℃延伸10 min. PCR產(chǎn)物置于4℃保存, 并使用質(zhì)量濃度為1%~2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測.

　　表 1 PCR引物序列

　　1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

　　根據普通PCR定性檢測的結果, 本研究對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 、floR共7種ARGs及16S rRNA進(jìn)行定量測定, 所用引物序列同表 1.采用SYBR Green Ⅰ方法、使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(BioRad CFX96 Touch, 美國)對各目標基因進(jìn)行定量測定.定量PCR采用20 μL體系, 包含10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM (TaKaRa, 中國), 引物各0.4 μL, DNA模板1 μL, ddH2O 8.2 μL.反應程序為: 95℃預變性1~2 min; 95℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán).溶解曲線(xiàn)程序為55~95℃, 每0.5℃讀數一次, 期間停留30 s.測定時(shí), 將標準質(zhì)粒以10倍梯度稀釋, 再根據質(zhì)粒濃度計算得到標準質(zhì)粒的拷貝數, 與通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定得到的Ct值對應可做出標準曲線(xiàn), 標準質(zhì)粒的構建方法參照張衍等[24]的研究.各目標基因的標準曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數在0.988~0.999之間.每個(gè)樣品均設置3個(gè)平行樣, 以減少誤差.

　　1.6 數據分析

　　使用Excel 2016和Past3.0對數據進(jìn)行分析, 相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)方法, P < 0.05(95%置信區間)被認為是顯著(zhù)相關(guān).

　　2 結果與討論2.1 兩座廢水處理系統進(jìn)水中ARGs存在情況

　　在27種ARGs中, P-Inf中共檢出了10種ARGs, I-Inf中共檢出了15種ARGs, 結果如表 2所示.與P-Inf相比, I-Inf中的ARGs種類(lèi)更為豐富.在檢出的ARGs中, 四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs的檢出較為普遍, 甲氧芐啶類(lèi)和大環(huán)內酯類(lèi)ARGs有少量檢出, 而β-內酰胺類(lèi)ARGs和萬(wàn)古霉素類(lèi)ARGs基本沒(méi)有檢出.檢測的7種四環(huán)素類(lèi)ARGs包含3種抗性機制為編碼外排泵蛋白的tetA、tetB、tetC基因和4種編碼核糖體保護蛋白的tetM、tetO、tetQ、tetW基因, 而檢出的基因都屬于后者, 這說(shuō)明編碼核糖體保護蛋白的四環(huán)素類(lèi)ARGs更有可能存在于廢水處理系統中.

　　

表 2 兩座廢水處理系統的進(jìn)水中ARGs檢出情況1)

　　2.2 兩座廢水處理系統中ARGs的分布特征

　　兩座廢水處理系統采集的樣品中目標基因的絕對豐度分布情況如圖 2所示.在所有水樣中, 16S rRNA濃度為3.94×107~7.34×108 copies ·mL-1, 高出ARGs濃度0.55~4.58個(gè)數量級; 除P-Ax以外, 其余生物單元水樣中16S rRNA的濃度均高于進(jìn)水和出水, 說(shuō)明微生物在生物處理單元有效地增殖.在泥樣中, 兩座廢水處理系統的二沉池污泥中16S rRNA濃度均在1011 copies ·g-1水平, 遠高于水樣中16S rRNA的濃度水平.有報道指出6個(gè)PWWTP水樣中16S rRNA主要在105~108 copies ·mL-1的濃度水平, 與本研究結果一致.另有研究顯示, 在我國杭州、哈爾濱等地的市政污水處理廠(chǎng)的水樣中, 16S rRNA在108~1012 copies ·mL-1的濃度水平, 明顯高于制藥廢水處理系統水樣中的濃度水平.這意味著(zhù)與市政污水相比, 制藥廢水和工業(yè)廢水對微生物群落產(chǎn)生了更高的選擇性壓力, 因此兩個(gè)廢水處理系統中微生物濃度下降.相關(guān)性分析結果顯示(圖 3), 兩座廢水處理系統水樣中16S rRNA濃度與7種ARGs總濃度顯著(zhù)正相關(guān)(P < 0.01, r=0.884), 并且與sul Ⅰ (P < 0.05, r=0.818)和sul Ⅱ (P < 0.05, r=0.756)兩種磺胺類(lèi)抗性基因顯著(zhù)正相關(guān), 說(shuō)明廢水水樣中ARGs濃度受到微生物濃度變化的影響.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 2

圖中P-Slu和I-Slu樣點(diǎn)單位為copies ·g-1, 余下樣點(diǎn)為copies ·mL-1圖 2 兩座廢水處理系統中ARGs和16S rRNA的分布

　　圖 3

圖 3 廢水處理系統水樣中16S rRNA與總ARGs相關(guān)性

　　有研究指出在PWWTP中, 相比于抗生素濃度, 微生物濃度是影響ARGs的更為重要的因素.在兩座廢水處理系統的進(jìn)水中, ARGs濃度在1.79×103 copies ·mL-1(tetW, P-Inf)~6.14×103 copies ·mL-1(sul Ⅱ , I-Inf)之間, 其中, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因絕對豐度最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.兩座系統進(jìn)水中ARGs相對豐度的分布順序與絕對豐度一致(圖 4), 仍舊是sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因最高, 隨后依次是dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因.有研究顯示, sul Ⅰ 和sul Ⅱ 基因以105~107 copies ·mL-1的絕對豐度存在于不同的市政污水處理系統的進(jìn)水中, 濃度水平高于四環(huán)素類(lèi)ARGs[25, 29, 30], 在制藥廢水處理系統中也有同樣的情況, 這與本研究的結果一致.四環(huán)素類(lèi)ARGs中, tetO、tetQ和tetW基因在廢水處理系統中的分布較早地得到了關(guān)注, 在制藥廢水處理系統中也有研究.本研究對這3種四環(huán)素類(lèi)ARGs的相關(guān)性分析顯示, tetO基因與tetW基因顯著(zhù)正相關(guān)(P < 0.01, r=0.915), 而tetQ基因與tetO(P=0.27, r=0.442)、tetW(P=0.56, r=0.246)基因正相關(guān)但不顯著(zhù), 說(shuō)明這3種四環(huán)素類(lèi)ARGs在兩級廢水處理系統中的濃度水平具備相似性, 這可能與它們具備相同的抗性機制有關(guān).與四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs不同, 甲氧芐啶抗性基因dfrA 13 尚未有文獻報道存在于污水處理系統中.在本研究中, dfrA 13 的絕對豐度水平高于已有研究中檢出頻率較高的3種四環(huán)素類(lèi)ARGs, 這表明僅著(zhù)眼于四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs等高頻率被檢出的ARGs類(lèi)別, 對廢水處理系統中ARGs污染狀況的評估將是不全面的, 未來(lái)建議引入高通量qPCR、宏基因組等新技術(shù)進(jìn)行更加細致全面的研究.

　　圖 4

圖 4 兩座廢水處理系統中ARGs的相對豐度

　　P-Eff匯入I-Inf中, 再由IWWTP進(jìn)行處理. IWWTP需處理多種來(lái)源的生活污水和工業(yè)廢水, 不同廢水對I-Inf中ARGs的貢獻不同.每天P-Eff和I-Inf水樣的ARGs總量如表 3所示(ARGs總量估算方法:水樣中ARGs單位體積濃度系統每日處理水量), 可以看到:每天P-Eff對I-Inf中總ARGs的貢獻率為5.05%, 而每天P-Eff的水量?jì)H占I-Inf的0.87%, 說(shuō)明PWWTP對IWWTP中ARGs污染貢獻較大.更進(jìn)一步地, P-Eff對I-Inf中不同ARGs的貢獻率有較大差異, 貢獻率最高的為sul Ⅰ 基因, 達9.12%, 其后依次是floR、tetW、sul Ⅱ 、tetO、tetQ, 貢獻率最低的是dfrA 13 基因, 僅為0.17%.通過(guò)對水樣中ARGs物質(zhì)流的分析, 可以厘清IWWTP中不同來(lái)源廢水的ARGs貢獻率, 為未來(lái)有針對性地控制ARGs污染源提供指導.

　　表 3 ARGs在兩座廢水處理系統中的傳輸

　　2.3 兩座廢水處理系統對ARGs的作用

　　在兩座廢水處理系統中, 總ARGs濃度在生物處理單元中升高, 經(jīng)過(guò)二沉池的處理后, 出水中的總ARGs濃度下降, 其中ARGs濃度在1.27×103 copies ·mL-1(tetW, P-Eff)~3.31×106 copies ·mL-1(sul Ⅰ , P-Eff)之間.而二沉池污泥中, ARGs濃度在1.24×106 copies ·g-1(tetW, I-Slu)~6.19×109 copies ·g-1(sul Ⅱ , I-Slu)之間, ARGs濃度高于出水3~4個(gè)數量級(圖 2), 表明生物處理單元有可能促進(jìn)ARGs的擴增和傳播; 大量的ARGs從水中轉移到了泥中, 表明二沉池的污泥沉降作用可能是去除污水中ARGs的主要機制.

　　廢水處理系統對ARGs能否有效去除目前尚有爭議.在中國北方的兩座污水處理廠(chǎng)中, ARGs被證實(shí)得到了明顯的擴增和傳播, 而在意大利的3座污水處理廠(chǎng)中, 大多數ARGs能夠被顯著(zhù)地去除.在本研究中, 兩座廢水處理系統對ARGs的去除同樣表現出了差異(圖 5).總體來(lái)看, 經(jīng)PWWTP處理后ARGs濃度上升了0.21個(gè)數量級, 未表現出對ARGs的去除效果, 經(jīng)IWWTP處理后總ARGs濃度下降了1.03個(gè)數量級, 表明PWWTP對ARGs的去除效果相對較弱.進(jìn)一步分析不同基因, PWWTP僅對tetQ、sul Ⅱ 和dfrA 13 基因有去除作用, 分別去除了0.48、0.23和0.79個(gè)數量級; 而IWWTP對除了floR外的基因均表現出了去除效果, 對tetO、tetQ、tetW、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 、dfrA 13 以及16S rRNA分別去除了0.92、2.01、1.56、0.83、1.20、0.64及0.98個(gè)數量級. IWWTP對四環(huán)素類(lèi)ARGs表現出較好的去除效果, 這與浙江省、哈爾濱市、江蘇省多地的市政污水處理廠(chǎng)中的情況類(lèi)似.在3種四環(huán)素類(lèi)ARGs中, PWWTP和IWWTP對tetQ的去除效果最好, 這可能與tetQ基因在水環(huán)境中的遷移機制有關(guān).有研究表明在這3種四環(huán)素類(lèi)ARGs中, tetQ的遷移率最高, 推測其能夠快速地遷移到活性污泥中, 并隨著(zhù)污泥沉降作用離開(kāi)水體而得到去除.相比較之下, 磺胺類(lèi)ARGs較難被廢水處理系統去除, 推測可能與這兩種基因均位于高效的水平轉移元件上有關(guān)[36].經(jīng)PWWTP和IWWTP處理后, 氯霉素類(lèi)抗性基因floR的濃度分別上升了1.70和0.25個(gè)數量級, 由圖 2可以看出, 相較于進(jìn)水, floR基因濃度在好氧池出水中分別上升了1.12和1.05個(gè)數量級, 顯示其能夠在好氧環(huán)境中廣泛地擴增和傳播, 因此, floR基因在廢水處理系統中的分布值得重點(diǎn)關(guān)注.有研究關(guān)注了浙江省四座市政污水處理系統對ARGs的去除情況, 發(fā)現其對tetO、tetQ、tetW基因去除了2.0~3.5個(gè)數量級, 對sul Ⅰ 、sul Ⅱ 去除了1~2.5個(gè)數量級, 去除效果優(yōu)于本研究中的兩座廢水處理系統, 這意味著(zhù)與市政污水處理系統相比, 如何去除制藥廢水處理系統中的ARGs需要更多的關(guān)注.在作者團隊后期對該藥業(yè)集團廢水處理系統的調研中, 分別在系統進(jìn)水、水解酸化池出水和好氧池出水中檢出了濃度為5.06、4.88和3.23 mg ·L-1的鹽酸環(huán)丙沙星[37], 表明廢水處理系統中存在高濃度的抗生素, 對微生物群落造成較大的抗生素選擇壓力, 很可能導致系統中出現高豐度的ARGs, 并使得系統中的ARGs較難被去除.

　　圖 5

圖 5 兩座廢水處理系統對ARGs和16S rRNA的去除

　　本研究中的制藥廢水經(jīng)PWWTP和IWWTP兩級處理后, 最終出水(I-Eff)將排入臨近海域, 可能對受納水體的微生物群落產(chǎn)生影響, 引起抗生素抗性的蔓延和傳播, 進(jìn)而對人類(lèi)健康產(chǎn)生潛在風(fēng)險.此外, 高濃度的ARGs進(jìn)入二沉池污泥中, 可能通過(guò)污泥處理和處置過(guò)程而在土壤環(huán)境中引起ARGs的蔓延和傳播.廢水處理系統中常見(jiàn)的A2O、氧化溝等工藝是為去除廢水中的常規污染物而設計, 對ARGs沒(méi)有良好的去除效果在情理之中.為減少經(jīng)廢水處理系統排放至自然環(huán)境的ARGs的總量, 在保證常規污染物去除效率的基礎上, 強化ARGs的高效去除, 將是未來(lái)廢水處理技術(shù)發(fā)展需要應對的挑戰.

　　3 結論

　　(1) 在浙江省某精細化工園區的兩座廢水處理系統進(jìn)水中, 分別檢出了10種和15種ARGs, 其中高頻率檢出的是四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)ARGs; 磺胺類(lèi)ARGs的絕對豐度最高, 為105~106 copies ·mL-1, 隨后濃度由高到低依次為dfrA 13 、tetQ、floR、tetO和tetW基因; 首次檢出dfrA 13 抗性基因, 且其絕對豐度高于四環(huán)素類(lèi)ARGs.

　　(2) 兩座廢水處理系統的水樣中16S rRNA濃度低于市政污水處理系統的濃度水平, 并與7種ARGs的總濃度、sul Ⅰ 、sul Ⅱ 基因濃度顯著(zhù)正相關(guān).

　　(3) 制藥廢水處理系統出水僅占園區綜合性廢水處理系統總水量的0.87%, 而總ARGs的貢獻率為5.05%, 傳播輸出最高的3種ARGs為sul Ⅰ 、floR和tetW基因.

　　(4) 制藥廢水處理系統使廢水中總ARGs濃度上升0.21個(gè)數量級, 綜合性廢水處理系統使廢水中總ARGs濃度下降1.03個(gè)數量級; 最終出水直接排海, 可能對近海微生物群落產(chǎn)生影響, 應進(jìn)一步評估ARGs通過(guò)廢水處理系統進(jìn)入環(huán)境的濃度水平和健康效應.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué) 作者：李奧林)