1 引言
為了有效地控制水體富營(yíng)養化，強化生物除磷(Enhanced Biological Phosphorus Removal，簡(jiǎn)稱(chēng)EBPR)在廢水生物處理磷過(guò)程中起到了關(guān)鍵性作用(Oehmen et al., 2007).EBPR即在厭氧-好氧交替運行條件下，活性污泥中的聚磷微生物選擇性地富集成優(yōu)勢菌群，厭氧階段，聚磷菌(PAOs)通過(guò)分解胞內聚磷產(chǎn)生的能量，吸收胞外的揮發(fā)性脂肪酸，同時(shí)降解糖原提供還原力以合成聚β羥基烷酸酯(PHA);好氧階段，聚磷菌利用分解胞內的PHA產(chǎn)生的能量，用于細胞生長(cháng)、聚磷合成和糖原恢復，通過(guò)好氧末端排泥實(shí)現生物除磷的目的.
糖原是強化生物除磷過(guò)程中產(chǎn)生的一種胞內聚合物.PAOs在厭氧條件下吸收基質(zhì)不僅需要利用分解多聚磷酸鹽產(chǎn)生的能量，還需要糖原為其提供部分能量和還原力.因此，提供一種快速的分析污泥胞內糖原含量變化的方法將有助于對強化生物除磷原理的進(jìn)一步認識.目前，污泥胞內糖原的化學(xué)測定主要利用蒽酮比色法.測定原理主要是將冷凍干燥污泥進(jìn)行不同方式的預處理，利用強酸可使糖類(lèi)脫水生成糖醛，生成的糖醛或羥甲基糖醛與蒽酮脫水縮合，形成藍綠色的糖醛衍生物，該物質(zhì)在600~650 nm波長(cháng)處有最大吸收，可以得到吸光度值與糖原含量的線(xiàn)性關(guān)系(Chen et al., 2005).
利用蒽酮法測定污泥胞內糖原含量比較繁瑣，且容易造成污泥樣品的不可逆性破壞.污泥的紅外光譜分析亦是一種測定污泥胞內糖原含量的重要分析方法，近年來(lái)，伴隨著(zhù)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，傅里葉紅外光譜技術(shù)在科研領(lǐng)域逐漸得到了廣泛使用.紅外光譜技術(shù)可以對微克級甚至是納克級樣品進(jìn)行定性和定量分析，具有過(guò)程簡(jiǎn)便、噪聲低、光通量高、分辨率高、波數準確度高、測定的光譜范圍寬和掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)(翁詩(shī)甫，2005).
糖原是由葡萄糖通過(guò)化學(xué)鍵而聚合在一起的多聚物，具有特征的紅外光譜吸收峰.Garip等(2009)通過(guò)研究Micrococcus 種屬的細菌的紅外光譜發(fā)現，糖原的紅外吸收峰分別位于1074 cm-1和550 cm-1 處.Mehrotra等(2007)通過(guò)研究人體組織中正常細胞與癌癥細胞的紅外光譜，考察了蛋白、核酸和糖原的特征峰的峰位和峰強，比較了糖原與蛋白的峰強之比，定性和半定量地評價(jià)了從正常細胞向癌細胞轉變的過(guò)程.因此，通過(guò)糖原特征峰強度的變化可以定性或者半定量表征糖原含量的變化.進(jìn)一步而言，還可以采用偏最小二乘法(PLS)或者BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法對各類(lèi)樣品的紅外光譜進(jìn)行定量分析.例如，李振慶等(2009)采用改進(jìn)偏最小二乘回歸法將選出的波長(cháng)區與巴氏殺菌純牛乳中脂肪、蛋白質(zhì)及乳糖成分建立模型，結果表明，模型的擬合程度較高，得到了很好的預測效果.林萍等(2009)應用偏最小二乘法和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )相結合的方法對白砂糖、木糖醇、雙歧糖和葡萄糖進(jìn)行了定性分辨和定量分析.活性污泥樣品是十分復雜的混合物，課題組以前的研究中也曾比較了污泥樣品與標準樣品的紅外光譜峰，初步確定了糖原的特征吸收峰，并采用特征峰強度比值對活性污泥中的糖原含量進(jìn)行了初步定量表征(李瑞，2012).然而，僅僅通過(guò)峰位比對來(lái)確定目標物質(zhì)的特征吸收峰相對粗糙，若能采用標準加入法對污泥中的糖原峰進(jìn)行定性表征，則可以得到糖原物質(zhì)在污泥樣品中的一系列特征吸收貢獻區域.在此基礎上，選定特征光譜區間并采用偏最小二乘法或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )法建立樣品紅外光譜與糖原含量的關(guān)系模型，則可以用于未知樣品的快速表征和定量分析.基于此，本文采用傅里葉中紅外光譜對強化生物除磷過(guò)程中污泥胞內糖原物質(zhì)進(jìn)行表征，并將污泥樣品與糖原標樣的紅外光譜進(jìn)行對比.同時(shí)，采用紅外光譜945~1150 cm-1區域內的吸收光譜數據，結合測得胞內糖原的含量，應用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法分別建立污泥紅外光譜與糖原含量的定量分析模型.
2 材料與方法
2.1 反應器描述
采用序批式反應器(SBR)富集聚磷菌，以實(shí)現強化生物除磷的目的.反應器有效容積4 L，8 h一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)進(jìn)水2 L，以乙酸鈉為唯一碳源，COD為400 mg · L-1，NH4Cl作為微生物的唯一氮源，KH2PO4與K2HPO4作為微生物的磷源，進(jìn)水中磷的濃度為20 mg · L-1，碳磷比為20 ∶ 1.單個(gè)循環(huán)時(shí)間設置見(jiàn)表 1.反應器的水力停留時(shí)間為16 h，每個(gè)周期好氧末端排泥150 mL，污泥停留時(shí)間為8.9 d.
表1 反應器各階段運行時(shí)間
2.2 反應器進(jìn)水組成
反應器合成廢水由0.3 L溶液A和1.7 L溶液B組成，其中，溶液A和溶液B的組成成分見(jiàn)表 2.
表2 反應器進(jìn)水組分一覽表
2.3 樣品采集與實(shí)驗方法
待反應器進(jìn)水完成后，分別在0、30、60、90、120(厭氧末端)、150、180、240、300 min(好氧末端)時(shí)進(jìn)行取樣，共進(jìn)行了3次平行試驗.對取得的所有樣品進(jìn)行泥水分離，得到上清液和濕污泥樣品.對濕污泥進(jìn)行抽濾，然后放入FD-1A-180冷凍干燥機進(jìn)行冷凍干燥24 h，得到冷凍干燥污泥.取樣品上清液，根據《水和廢水監測分析方法》對COD和正磷酸鹽進(jìn)行檢測分析(魏復盛，2002).
冷凍干燥污泥的蒽酮比色測定方法如下：取10 mg冷凍干燥污泥，加入10 mL 75%的硫酸溶液反復振蕩，在100 ℃下消解10 min，取1 mL稀釋至10 mL，再從10 mL中取1 mL在冰水浴中加入蒽酮試劑(取0.2 g蒽酮溶解到80%硫酸中，以80%硫酸定容到100 mL，現配現用)5 mL，轉移至沸水浴中加熱10 min，取出試管重新置于冰水浴冷卻至室溫，用分光光度計在620 nm處測定吸光度值.
采用中紅外透射法測量樣品時(shí)，基質(zhì)溴化鉀(KBr)與樣品的合理壓片過(guò)程能有效避免量測光譜時(shí)出現克里斯坦森效應(黃冬晨等，2013).因此，冷凍干燥污泥的傅里葉紅外光譜檢測方法如下：利用KBr作為背景，將KBr用研缽壓制成薄片并放入傅里葉紅外光譜中掃描，得出背景光譜;在KBr中加入1%的待測污泥樣品，在研缽中進(jìn)行混勻后壓制成薄片再次放入傅里葉紅外光譜中掃描，得到待測污泥樣品的傅里葉紅外光譜圖.
3 結果與討論
3.1 反應器的運行狀態(tài)
圖 1是第一次實(shí)驗的化學(xué)分析結果.從測得的化學(xué)指標可以看出，反應器進(jìn)水COD為166.5 mg · L-1，正磷酸鹽濃度為22.5 mg · L-1，經(jīng)過(guò)30 min的厭氧攪拌后，廢水中的COD基本完全降解，這可能是活性污泥的初期吸附所造成的底物濃度迅速下降;2 h后的厭氧末端COD降解到81.0 mg · L-1，正磷酸鹽濃度上升至160.5 mg · L-1，聚磷菌胞內的釋磷量為進(jìn)水的6倍，說(shuō)明伴隨著(zhù)底物(乙酸鈉)的不斷降解，微生物胞內的聚磷被利用降解成正磷酸鹽釋放到細胞外的水體中，導致水體中的正磷酸鹽含量增加，厭氧末端水體中的正磷酸鹽濃度達到最大.經(jīng)過(guò)后期3 h的曝氣處理后，伴隨著(zhù)水體中COD的進(jìn)一步降解利用，水體中的正磷酸鹽被微生物過(guò)量吸收并以聚磷的形式儲存于細胞內，好氧末端COD為48.0 mg · L-1，正磷酸鹽濃度為15.44 mg · L-1.通過(guò)每周期排150 mL污泥的形式達到了生物除磷的目的.
圖 1 SBR反應器運行過(guò)程中水質(zhì)指標和胞內糖原物質(zhì)含量的變化
在EBPR反應器處理廢水過(guò)程中，糖原不僅可以為厭氧階段提供一部分能量，還可以為PHA的合成提供還原力.在厭氧階段所消耗的糖原伴隨著(zhù)好氧階段PHA的分解利用和底物的進(jìn)一步消耗而得到了補充.從圖 1可以看出，在厭氧末端(120 min)，污泥胞內糖原含量達到最低，占污泥總質(zhì)量的6.45%，經(jīng)過(guò)曝氣3 h后，污泥胞內糖原的含量上升至8.78%.說(shuō)明在生物除磷過(guò)程中，污泥胞內的糖原物質(zhì)參與了微生物的活動(dòng).
3.2 標準污泥胞內聚合物的紅外光譜分析
由于多糖分子中的C—OH伸縮振動(dòng)頻率與醇分子中的C—OH伸縮振動(dòng)頻率基本相同，位于1200~1000 cm-1之間，但多糖分子中又存在多個(gè)C—OH基團.因此，從圖 2a可以看出，在這個(gè)區域往往會(huì )出現幾個(gè)峰位，圖中1020、1082和1158 cm-1處的特征峰是來(lái)自糖原分子中C—OH的吸收(Taylor et al., 2011).從圖 2b可以看出，聚磷(poly-P)的特征峰主要有兩個(gè)，一個(gè)位于1167 cm-1處的主峰和一個(gè)位于900 cm-1的次峰，它們分別是由PO2對稱(chēng)伸縮振動(dòng)和P—OH基團的伸縮振動(dòng)引起的吸收峰.從圖 2c和2d分別可以看出，PHB的紅外特征峰主要位于1723 cm-1處，牛血清蛋白(BSA)在1657 cm-1和1541 cm-1處分別有較強的I吸收峰、II吸收峰，這與之前文獻(Padermshoke et al., 2005; Adt et al., 2006)中報道的結果十分吻合.
圖 2 標準糖原、聚磷(多聚磷酸鹽)、PHB和牛血清蛋白(BSA)的紅外光譜圖
為了進(jìn)一步說(shuō)明污泥胞內糖原分子C—OH基團在1020、1082和1158 cm-1處有很強的吸收峰，本文在污泥樣品中加入不同含量的標準糖原樣品，得到的光譜圖見(jiàn)圖 3.從圖 3可以看出，加入糖原后，紅外光譜在1020、1082和1158 cm-1處有顯著(zhù)增加，并且隨著(zhù)糖原投加比例的增加，其吸收峰強度明顯加強，其中，在1020 cm-1的吸光度分別從0.185增加為0.237和0.379.因此，應該優(yōu)先選用該處的紅外峰作為糖原的特征峰.
圖 3 活性污泥中加入不同比例的標準糖原物質(zhì)后的紅外光譜圖
3.3 污泥樣品的紅外光譜分析
圖 4是第一次實(shí)驗各取樣時(shí)間節點(diǎn)的污泥樣品紅外光譜圖，由于污泥樣品在1158 cm-1處的吸收峰強度不是很明顯，故采用1020 cm-1與1082 cm-1處糖原分子的吸收峰強度來(lái)反映污泥胞內糖原含量的變化.就1020 cm-1處的紅外吸收而言，進(jìn)水開(kāi)始階段污泥胞內的糖原分子的C—OH特征峰強度相對較高，吸收值為0.611.進(jìn)入厭氧階段后，強度逐漸減弱，厭氧1 h后，降至0.585，到厭氧末期達到最低，降至0.549.經(jīng)過(guò)好氧階段處理后，胞內糖原的特征峰強度明顯升高，好氧1、2、3 h的1020 cm-1處紅外峰吸光度分別為0.584、0.619和0.648，這顯然與蒽酮比色法測得的糖原含量變化趨勢是一致的.
圖 4 反應器不同運行節點(diǎn)的污泥樣品紅外光譜圖
3.4 污泥胞內糖原含量的偏最小二乘和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法分析定量模型
采用前兩次實(shí)驗獲得的18個(gè)樣品在945~1150 cm-1區域內的中紅外光譜數據建立模型，并利用第3次實(shí)驗獲得的9個(gè)污泥樣品數據驗證模型的有效性.將光譜數據經(jīng)過(guò)歸一化處理后轉化為吸光度數據，利用偏最小二乘法建立光譜數據與化學(xué)指標之間的定量分析模型，結果見(jiàn)圖 5和圖 6.
圖 5 交叉驗證預測殘差平方和PRESS隨主成分個(gè)數的變化趨勢圖 
圖 6 提取的自變量和因變量信息隨主成分個(gè)數的變化趨勢圖
以光譜數據為自變量，以糖原的化學(xué)分析結果為因變量，利用偏最小二乘法提取自變量的主成分個(gè)數.從圖 5和圖 6可以看出，隨著(zhù)主成分個(gè)數的增加，交叉驗證預測殘差平方和PRESS呈現出逐漸減小的變化趨勢，而提取的自變量和因變量信息卻一直呈現出增加的趨勢.當自變量主成分個(gè)數為4時(shí)，PRESS基本已達到最低點(diǎn)，此時(shí)體現了99.52%的自變量信息和98.68%的因變量信息.隨著(zhù)主成分個(gè)數的繼續增加，PRESS有所增加，而體現的信息量卻變化很小，說(shuō)明過(guò)擬合將噪聲組分添加到模型中后，模型預測效果會(huì )變差(朱爾一，2005;吳桂芳等，2008).故選擇該模型的最佳主成分個(gè)數為4，此時(shí)的測量值與預測值的相關(guān)性如圖 7a示.
圖 7 測量值與預測值之間的相關(guān)關(guān)系圖(a.PLS法；b.BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )法)
BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法將選取的中紅外光譜數據作為訓練樣本集，污泥胞內糖原的化學(xué)指標作為測試樣本集.第一隱含層神經(jīng)元個(gè)數為5個(gè)，采用的是雙曲正切S型傳遞函數(tansig);第二層輸出層神經(jīng)元個(gè)數為1個(gè)，采用的是線(xiàn)性傳遞函數(purelin)，利用彈性梯度下降法的訓練函數(trainrp).網(wǎng)絡(luò )配置參數設置為訓練顯示間隔50次，最大迭代次數500次，學(xué)習步長(cháng)0.05，期望目標誤差最小值為10-4.對該網(wǎng)絡(luò )進(jìn)行訓練10次，從10次訓練結果中選擇相關(guān)程度最高的作為污泥胞內糖原含量的預測模型.該預測模型的均方誤差(Mean Squared Error，MSE)隨循環(huán)次數的增加而減小，最終基本達到期望目標誤差最小值，變化過(guò)程如圖 8所示，其相關(guān)關(guān)系如圖 7b所示.
圖 8 均方誤差(MSE)隨循環(huán)次數的變化趨勢圖
應用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法分別建立污泥樣品的紅外光譜與胞內糖原的化學(xué)指標之間的分析定量模型，這兩種模型得出糖原的測量值與預測值之間的相關(guān)系數分別為0.921、0.893.并采用第3次實(shí)驗的9個(gè)污泥樣品驗證上述模型的有效性，其誤差分析比較見(jiàn)表 3.
表3 糖原百分含量的測量值與預測值的比較
偏最小二乘法模型的交叉驗證均方根殘差RMSEC=0.22%，預測值的平均絕對誤差為0.19%，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法模型的預測值平均絕對誤差為0.32%，表明采用偏最小二乘法比神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法具有更小的平均絕對誤差. 由于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法的預測性受隱含層神經(jīng)元個(gè)數的影響，其中，隱含層神經(jīng)元個(gè)數過(guò)少，網(wǎng)絡(luò )中的權重不充分，此時(shí)的網(wǎng)絡(luò )不能夠較好地描述試樣集的固有規律，即不能夠得到很好的預測數學(xué)模型;隱含層神經(jīng)元個(gè)數過(guò)多，會(huì )發(fā)生過(guò)擬合，使誤差變大(焦淑菲等，2010).而偏最小二乘法則不受這些因素的影響，并且在線(xiàn)性相關(guān)程度上也明顯優(yōu)于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法.因此，偏最小二乘法是污泥胞內糖原物質(zhì)定量分析的一種快速有效方法.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結論
1)在厭氧-好氧交替的強化生物除磷過(guò)程中，伴隨著(zhù)底物乙酸鈉的降解，污泥胞內的糖原存在著(zhù)厭氧分解和好氧合成的兩個(gè)過(guò)程，其變化可以通過(guò)紅外光譜來(lái)表征.
2)污泥樣品的紅外光譜圖中位于1020 cm-1與1082 cm-1處的峰來(lái)自于糖原分子中C—OH的貢獻，該特征峰的強弱可以直觀(guān)地反映出在生物除磷過(guò)程中污泥胞內糖原的變化過(guò)程.
3)利用偏最小二乘法和BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法分別建立污泥樣品945~1150 cm-1區域的紅外光譜數據與蒽酮比色法測得的化學(xué)指標之間的定量分析模型.結果顯示，偏最小二乘法比BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )算法預測污泥胞內糖原物質(zhì)具有更好的預測精度和較小的平均絕對誤差，其測量值與預測值的相關(guān)系數為0.921，平均絕對誤差達到0.19%.
