1 引言
隨著(zhù)抗生素廣泛使用，環(huán)境中檢測到的抗生素種類(lèi)繁多，其環(huán)境殘留濃度也逐年升高.另外，由于抗生素對生態(tài)平衡的影響和人體健康潛在威脅的暴露，抗生素的環(huán)境行為倍受人們關(guān)注.目前，國內外學(xué)者對抗生素的研究主要集中在其環(huán)境殘留，對微生物、動(dòng)植物的毒理作用，以及其抗性基因的檢測，而對其在環(huán)境中的遷移、轉化特征報道較少.紅霉素(Erythromycin，ERY)屬于大環(huán)內酯類(lèi)抗生素，具有廣譜的抗菌作用，被廣泛應用于醫藥行業(yè)和畜禽養殖業(yè)，是經(jīng)常使用且環(huán)境檢出率較高的抗生素之一.環(huán)境中檢測出的紅霉素多以脫水紅霉素(Anhydroerythromycin，ERY-H2O)形式存在，紅霉素及脫水紅霉素的分子結構如圖 1所示.據報道，在中國各流域中，如長(cháng)江、珠江、嘉陵江等都能檢測到紅霉素的存在，并且濃度呈上升趨勢.例如，在香港維多利亞港紅霉素濃度在2007年時(shí)為3.5~5.2 ng · L-1，2009年上升到4.7～1900 ng · L-1.水環(huán)境中廣泛檢出的紅霉素將如何在水生生態(tài)系統中遷移并產(chǎn)生怎樣的生態(tài)效應，無(wú)疑是評估紅霉素的生態(tài)風(fēng)險所必需了解的.目前，圍繞抗生素在水生生態(tài)系統中分布特征的研究多基于實(shí)際環(huán)境采樣分析，由于無(wú)法控制污染源和實(shí)驗條件，所得實(shí)驗結果多存在誤差，不利于正確評估抗生素的環(huán)境風(fēng)險.采用微宇宙實(shí)驗裝置建立模擬水生生態(tài)系統由于具有體積小、易操作、且可人為控制其各理化性質(zhì)與自然環(huán)境相似的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于研究污染物在生態(tài)系統中遷移和生態(tài)效應.本文選用紅霉素為代表抗生素，采用微宇宙實(shí)驗裝置建立模擬水生生態(tài)系統，研究紅霉素在水、沉積物及生物體不同相中的分布特征，以期為正確評價(jià)紅霉素以及抗生素的環(huán)境風(fēng)險提供科學(xué)依據.
圖 1 紅霉素結構圖(a)和脫水紅霉素結構圖(b)
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗材料
脫水紅霉素(純度> 95%)購自加拿大Toronto Research Chemicals公司，-20 ℃保存;乙腈和甲醇均為色譜純，購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司，其他試劑均為分析純，購自國藥試劑有限公司;實(shí)驗用水為超純水，由Milli-Q超純水儀制備(Merck Millipore Advantage A10).
模擬生態(tài)系統所用水蘊草(Elodea densa)及斑馬魚(yú)(Barchydanioreriovar)購自廣州芳村花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng).水蘊草平均濕重為6.63 g ·棵-1，含水率為84.24%;斑馬魚(yú)平均重量為0.0656 g ·條-1.
2.2 實(shí)驗設計
微宇宙系統建立:微宇宙實(shí)驗裝置參考美國環(huán)保署的標準方法(Acute Dermal Toxicity，1996)采用室內靜水養殖系統箱構建.向養殖箱(80 cm×40 cm)內加入約20 kg的沉積物，然后加60 L水.栽入水蘊草，老化運行一段時(shí)間后，放入經(jīng)馴化的斑馬魚(yú)，實(shí)驗期間室內溫度控制在(30±2)℃，pH值控制在7.0±0.2、溶氧>4 mg · L-1.系統穩定后，加入脫水紅霉素溶液(用3 mol · L-1 H2SO4調節紅霉素溶液的pH值到3.0，在室溫下攪拌4 h)，使系統水相紅霉素濃度達到500 μg · L-1.分別在0、0.5、1、4、7、10、14、21、30 d取樣，分別檢測水、沉積物、水草和魚(yú)中脫水紅霉素的含量，每種樣品設3個(gè)平行樣.
空白對照實(shí)驗:把1 L 500 μg · L-1紅霉素溶液倒在燒杯中，放置在與微宇宙系統相同的位置，分別在0、0.5、1、4、7、10、14、21、30 d取樣，檢測水中紅霉素濃度.
2.3 樣品預處理
水樣預處理參考吳維等(2011)測定飲用水體中抗生素殘留的方法:水樣過(guò)0.45 μm混合纖維樹(shù)脂濾膜，用3.0 mol · L-1 H2SO4溶液調節水樣pH，然后用預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進(jìn)行富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹至近干，最后用甲醇定容，待測.
沉積物和水草預處理參考徐維海(2007)測定珠江沉積物中抗生素含量的方法:樣品經(jīng)冷凍干燥研磨后，稱(chēng)取適量置于離心管中，加入15 mL乙腈/檸檬酸鉀緩沖溶液(按體積比1∶1)，超聲提取15 min，離心，轉移上清液，并重復提取3次;合并上清液，旋轉蒸發(fā)至近干，加入 Na2EDTA溶液重溶，然后加入預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進(jìn)行凈化富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹掃至近干，最后用甲醇定容，待測.
魚(yú)預處理參考Jo等(Jo et al., 2011)檢測魚(yú)體和蝦內大環(huán)內脂類(lèi)抗生素殘留的方法:樣品經(jīng)冷凍干燥研磨后，稱(chēng)取適量樣品置于離心管中，向離心管中加入10 mL乙腈，超聲提取15 min，離心，轉移上清液，重復提取3次，合并上清液.向提取液中加入正己烷，振蕩去脂10 min，離心，除去正己烷層，重復去脂1次;提取液旋蒸至近干，然后加入 Na2EDTA溶液重溶，再加入預先經(jīng)甲醇、超純水、Na2EDTA的緩沖溶液活化的HLB小柱進(jìn)行凈化富集，再以5 mL甲醇淋洗HLB小柱，洗脫液收集于離心管中，在室溫下用N2吹掃至近干，最后用甲醇定容，待測.
2.4 分析方法
紅霉素采用Agilent 1200 高效液相色譜和Agilent 6410 Triple Quad串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測.色譜條件:色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×150 mm，3.5μm)，前接ODS Hypersil預柱(2.1 mm×10 mm，5 μm);柱溫30 ℃，流動(dòng)相:乙腈(A)∶0.5% 甲酸溶液(B)=90∶10;流速0.25 mL/min;進(jìn)樣量10 μL.質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧(Electrospray ionization，ESI)，正離子掃描;監測方式為多反應監測(Multiple Reaction Monitoring，MRM)，電噴霧電壓:4000 V;干燥氣:N2(11 L · min-1，300 ℃);霧化氣壓力:15 psi.
2.5 數據分析模型
一級動(dòng)力學(xué)模型:
式中，C0為水相中化合物初始濃度(ng · mL-1);t為時(shí)間(d);Ct為時(shí)間t時(shí)水相中化合物濃度(ng · mL-1).
沉積物-水分配系數Kd:
式中，CS為沉積物中化合物含量(ng · g-1);CW為水相中化合物濃度(ng · mL-1).
生物富集系數BCF：
式中，CB為生物體內化合物含量(ng · g-1);CW為水相中化合物濃度(ng · mL-1).
3 結果與討論(Results and discussion) 3.1 紅霉素在水體和沉積物中的變化
水中紅霉素濃度隨時(shí)間變化如圖 2所示.從圖中可以看出，紅霉素在水相的濃度隨著(zhù)時(shí)間的增加逐漸減小.加藥12 h后，水中紅霉素濃度由初始的503.86 ng · mL-1迅速降到298.56 ng · mL-1，然后平緩降至30 d的188.14 ng · mL-1，水中紅霉素消減率為62.66%.從空白對照實(shí)驗數據可以看出，水相紅霉素30 d的消減率為12.96%.由于紅霉素屬難揮發(fā)化合物，系統水相紅霉素濃度的減少可能主要是遷移至系統中其他相的緣故.
圖 2 水中紅霉素濃度隨時(shí)間變化
紅霉素在沉積物中的含量隨時(shí)間的變化如圖 3所示.從圖中可以看出，紅霉素在沉積物中的含量持續上升. 30 d時(shí)沉積物中紅霉素含量升至973.95 ng · g-1，這可能是與沉積物對紅霉素的吸附有關(guān).這與文獻報道相符，土壤和沉積物對抗生素表現出較強的吸附能力，且主要受沉積物的有機物含量影響(Liang et al., 2013).沉積物中富含的有機質(zhì)可提供陽(yáng)離子交換位點(diǎn)，促進(jìn)紅霉素在沉積物上的吸附.
3.2 紅霉素在生物體中的含量變化
圖 4說(shuō)明了紅霉素在水草和斑馬魚(yú)體內含量隨時(shí)間的變化情況.從圖中可以看出，水草中紅霉素的含量在3 d時(shí)達到最高值12581.27 ng · g-1，然后維持在一個(gè)穩定值，在15 d時(shí)水草中紅霉素含量開(kāi)始下降，于30 d時(shí)降至6745.96 ng · g-1，這可能與水草的生理特性有關(guān).水生植物的表皮薄，可直接從水中吸收水分和養分.初始紅霉素在水相的濃度較高，水中的紅霉素在濃度梯度作用下自由擴散被吸收進(jìn)入水草體內，并在體內積累;由于水生植物對紅霉素有代謝降解作用(Pomati et al., 2004)，進(jìn)入水草體內的紅霉素存在吸收和降解的平衡，故水草中紅霉素含量維持相對穩定;之后，隨著(zhù)水相紅霉素濃度的降低，水草從水中吸收紅霉素速度減慢，慢于其代謝紅霉素的速率，水草內紅霉素濃度開(kāi)始下降.
圖 4 生物體中紅霉素隨時(shí)間變化
斑馬魚(yú)體內紅霉素含量隨時(shí)間的變化大致相同，呈現先增加后下降的規律.在3 d時(shí)達到最高值1285.42 ng · g-1，不同之處在于，斑馬魚(yú)體內沒(méi)有吸收與降解的平衡過(guò)程.3 d后即開(kāi)始減少，30 d時(shí)斑馬魚(yú)體內紅霉素濃度降到308.52 ng · g-1，這可能是與水生魚(yú)類(lèi)與水生植物對污染物的吸收代謝作用存在差別有關(guān).魚(yú)類(lèi)通過(guò)腮呼吸、皮膚接觸或攝食水中微生物和懸浮顆粒吸收水中紅霉素;同時(shí)，可通過(guò)新陳代謝或排泄作用將紅霉素轉化或排出.這與文獻報道結果相一致，Vendrell等(Vendrell et al., 2012)研究了紅霉素在虹鱒魚(yú)體內富集與代謝動(dòng)力學(xué)特性發(fā)現:虹鱒魚(yú)對紅霉素有代謝降解作用，在實(shí)驗初始時(shí)虹鱒魚(yú)體內紅霉素濃度為1173.83 ng · g-1，在第8 d時(shí)虹鱒魚(yú)體內紅霉素濃度低于檢測限.
3.3 紅霉素在水生生態(tài)系統中的分布規律
圖 5為紅霉素在模擬生態(tài)系統各相的分布情況.從圖中可以看出，水中紅霉素逐漸減少.用一級動(dòng)力學(xué)方程對紅霉素在空白試驗和模擬生態(tài)系統水相中的消減數據進(jìn)行擬合，擬合參數如表 2所示.從擬合結果可以看出，紅霉素在空白實(shí)驗中的半衰期為113 d，而在模擬生態(tài)系統水相中的半衰期為42 d，這主要是由于模擬生態(tài)系統中其它相的存在促進(jìn)了水相中紅霉素的消減.Carstens等(Carstens et al., 2013)曾研究磺胺在水-底泥模擬生態(tài)系統中的轉化，結果發(fā)現:磺胺在不同水-底泥模擬生態(tài)系統水相中半衰期為2.7~17.8 d，與之相比，紅霉素的殘留時(shí)間更長(cháng)，應當考慮其對水生生態(tài)系統的影響.
圖 5 紅霉素在模擬系統中的分布規律(a)和生物體中所占投加量百分比
表 2 紅霉素在水相中的一級動(dòng)力學(xué)擬合參數
紅霉素進(jìn)入模擬生態(tài)系統后將發(fā)生遷移.沉積物是紅霉素的主要富集場(chǎng)所.為了評價(jià)其在沉積物中的積累能力，這里用沉積物-水分配系數來(lái)進(jìn)行評估.Kd值越大，則積累能力越強.通過(guò)計算得出，紅霉素的最高Kd值為5.18 L · kg-1，與文獻報道數據相一致.Zhang等(Zhang et al., 2011)報道了泰樂(lè )菌素在不同農業(yè)土壤上的Kd在1.7到12 L · kg-1之間;Thiele和Tolls(Thiele，2000; Tolls，2001)報道，磺胺類(lèi)抗生素在不同pH和有機質(zhì)含量的土壤上Kd為2.4和3 L · kg-1.而Liang等(Liang et al., 2013)采集實(shí)際沉積物樣品計算得出，脫水紅霉素在珠江口沉積物中的Kd為105 L · kg-1，Kim等(Kim and Carlson，2007)算得紅霉素在Cache La Poudre河中的采集的實(shí)際樣品的分配系數Kd為211 L · kg-1.可見(jiàn)根據實(shí)際樣品計算的分配系數顯著(zhù)高于實(shí)驗所得，這可能是由于實(shí)際環(huán)境中沉積物中的紅霉素是長(cháng)期積累的結果，因此并不能真實(shí)反映沉積物對抗生素的實(shí)際積累能力.因此，僅通過(guò)對實(shí)際環(huán)境樣品進(jìn)行采樣分析得出的沉積物-水分配系數，可能會(huì )高估沉積物的積累能力.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
同時(shí)，水草和斑馬魚(yú)對紅霉素也表現出一定的富集作用.生物富集系數BCF是評估化合物在水生生物體內富集情況，以及評估化合物對生物體毒性的重要參數.通過(guò)計算紅霉素在斑馬魚(yú)和水草體內的生物富集系數BCF，對紅霉素在斑馬魚(yú)和水草體內的富集情況進(jìn)行比較，發(fā)現:紅霉素在水草中的富集能力高于斑馬魚(yú).計算所得紅霉素在水草中的富集系數BCF最高值達到46.05 L · kg-1，而在斑馬魚(yú)體內則僅為4.40 L · kg-1，相差一個(gè)數量級.化合物在生物體的富集除了和生物體的脂肪含量相關(guān)外，還與化合物在生物體代謝速率有關(guān).紅霉素在水草中的富集能力比在斑馬魚(yú)體內高，可能是與紅霉素在斑馬魚(yú)體內的代謝速率較快有關(guān).Liu等(Liu et al., 2013)研究羅紅霉素在鯽魚(yú)體內的富集、代謝發(fā)現:羅紅霉素在鯽魚(yú)肝、血液、腮和肌肉的BCFs分別為2.15~38.0、0.950~20.7、0.0506~19.7和0.0439~13.8 L · kg-1，同時(shí)研究指出魚(yú)體血液中羅紅霉素的代謝產(chǎn)物與人體血液羅紅霉素的代謝產(chǎn)物一致.根據國際的生物蓄積性標準BCF > 5000 L · kg-1判斷，紅霉素屬于非生物累積性物質(zhì).但需要注意的是，盡管紅霉素屬于非生物累積性物質(zhì)，卻依然可對水生生物產(chǎn)生一定的毒性作用.紅霉素在水草中富集量少，但其含量已達到6000 ng · g-1以上，顯著(zhù)高于文獻報道的最大半數有效濃度0.036 mg · L-1，而且據Eguchi等(Eguchi et al., 2004)的研究發(fā)現，低濃度紅霉素即可對水生植物的生長(cháng)產(chǎn)生影響，Vannini等(Vannini et al., 2011)的研究指出抗生素被水生植物吸收后主要富集葉綠體及光合器內，進(jìn)而抑制其的光合作用，而光合作用是生態(tài)系統的基礎.對于魚(yú)類(lèi)而言，Kiryu等(Kiryu and Moffitt， 2002)研究紅霉素對4種不同鮭魚(yú)半數致死劑量LD50為350~1041 mg · kg-1.雖然本研究中魚(yú)體內的紅霉素濃度低于文獻報道的半數致死劑量，但根據美國科學(xué)院的毒性物質(zhì)危險劃分標準，從斑馬魚(yú)對紅霉素的富集能力看，紅霉素對魚(yú)類(lèi)的毒性依然表現出輕度毒性.由于紅霉素在水生植物體內的代謝能力低于魚(yú)類(lèi)，同時(shí)又表現出一定的毒性和敏感性，因此，在評估紅霉素的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險時(shí)，應注意其對水生植物的影響.
4 結論
紅霉素進(jìn)入模擬水生生態(tài)系統后，水相的半衰期為42 d，沉積物為主要富集場(chǎng)所，可積累56.46%的紅霉素;同時(shí)，水草和斑馬魚(yú)對紅霉素亦有一定的吸收富集能力，水草和斑馬魚(yú)可分別吸收和富集1.04%和0.0402%的紅霉素;水草對紅霉素的富集能力高于斑馬魚(yú)，其最高富集系數在水草和斑馬魚(yú)內分別為46.05 L · kg-1和4.40 L · kg-1，在考慮評估紅霉素的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險時(shí)，應注意其對水生動(dòng)植物的影響.
