1 引言
水質(zhì)基準是制定水質(zhì)標準的科學(xué)依據，目前針對我國水域的水質(zhì)基準研究較少，我國現行水質(zhì)標準主要依據國外水質(zhì)基準數值確定，但水質(zhì)狀況與生物區系的不同會(huì )造成水質(zhì)基準的明顯差異.因此，依據我國國情開(kāi)展水質(zhì)基準研究已經(jīng)成為我國水環(huán)境管理的迫切需求.
菲(Phenanthrene，PHE)，是多環(huán)芳烴中最具代表性的物質(zhì)之一，屬于內分泌干擾物質(zhì)，由于它被廣泛應用于合成樹(shù)脂、農藥、染料、醫藥、防霉劑和鞣料等工業(yè)里，因此在空氣、水體、土壤和動(dòng)植物體內的檢出率較高.目前在國內外許多水體中都曾檢測出菲，如美國新澤西州河口PilesCree水域中菲含量為80~800 ng·g-1，尼日利亞Siokolo島水域中菲含量為1.46 μg·mL-1.有研究顯示，菲對雙殼貝類(lèi)、甲殼類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、水生昆蟲(chóng)等動(dòng)物都有潛在的毒性，原因是菲結構中的9、10雙鍵具有高電子密度，易與細胞內的DNA、RNA等物質(zhì)結合而引起致毒作用，并且菲的結構中還具有與致癌性相關(guān)的K區(K-region)和灣區(bayregion).通過(guò)開(kāi)展菲的水生生物基準閾值研究，可以填補我國本土水生生物菲的生態(tài)毒性數據空白，為我國菲的水生生物基準建立、環(huán)境管理工作提供技術(shù)支持.
本研究根據我國淡水生物區系特征綜合考慮物種篩選原則及影響因素，同時(shí)結合美國的水質(zhì)基準“指南”中“三門(mén)八科”最低毒性數據要求，選擇具有代表性的“四門(mén)八科”9種本土水生生物(錦鯉、麥穗、泥鰍、澤蛙蝌蚪、大型溞、青蝦、搖蚊幼蟲(chóng)、霍甫水絲蚓和水螅屬)進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)急性和慢性實(shí)驗，在推導出菲本土水生生物基準閾值的同時(shí)，與美國水生生物已報道毒性數據進(jìn)行本土與美國物種毒性敏感度分析比較，探究非美國水生生物毒性數據進(jìn)行我國本土水生生物基準研究的可行性.
2 材料與方法 2.1 實(shí)驗材料
學(xué)術(shù)界一般認為，魚(yú)類(lèi)、浮游生物、底棲動(dòng)物和植物可表征復雜水生態(tài)系統的結構特征和功能.按照美國水質(zhì)基準“指南”中“三門(mén)八科”最低毒性數據要求，參照《中國脊椎動(dòng)物大全》(李明玉等，2000)和《中國生物多樣性國情研究報告》(國家環(huán)境保護總局，1998)等文獻資料，我國水質(zhì)基準推導的試驗生物基本可采用“指南”規定的物種選擇原則，但必須包括鯉科魚(yú)類(lèi);另外由于我國鯉科數量龐大，因此本文選用兩種鯉科魚(yú).根據我國淡水生物區系特征，結合美國和歐盟推導水質(zhì)基準的物種選擇，初步確定了菲基準研究所需本土生物物種，分別是脊索動(dòng)物門(mén)鯉科(錦鯉、麥穗魚(yú))、鰍科(泥鰍)、蛙科(澤蛙蝌蚪)，節肢動(dòng)物門(mén)溞科(大型溞)、蝦科(青蝦)、搖蚊科(搖蚊幼蟲(chóng))，環(huán)節動(dòng)物門(mén)顫蚓科(霍甫水絲蚓)，腔腸動(dòng)物門(mén)水螅蟲(chóng)科(水螅屬)，共“四門(mén)八科”9種本土水生動(dòng)物.另外，本研究系統全面的搜集了菲的水生植物毒性數據，但滿(mǎn)足毒性數據篩選原則(US EPA，1985)的數據十分匱乏，僅搜集到浮萍(Lemna minor)的LC50數據，本研究選用此數據進(jìn)行基準閾值推導.
9種本土水生動(dòng)物購自朝來(lái)春及大森林水產(chǎn)市場(chǎng)，正式試驗前均在實(shí)驗室馴養至少7 d;大型溞(Daphnia magna)，溞齡 < 24 h，由中國環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準與風(fēng)險評估國家重點(diǎn)實(shí)驗室提供.水生生物培養條件為：pH為8.0±0.2，DO為(8.3±0.3) mg·L-1，溫度為(22±2) ℃，試驗類(lèi)型采用換水式，每24 h換1次水，急性試驗不喂食，慢性試驗按照0.1%生物質(zhì)量1 d喂食兩次;溞類(lèi)光照周期為12 h:12 h.
受試物種選擇依據如下：當受試物種為水溞或其他水溞類(lèi)動(dòng)物時(shí)，應使用齡期小于24 h的生物進(jìn)行試驗;當受試物種為蚊類(lèi)時(shí)，應使用其第2代或第3代幼蟲(chóng)進(jìn)行試驗;當受試物種為魚(yú)類(lèi)或其他物種時(shí)，應使用幼齡期的生物(至少要先于性腺發(fā)育前60 d)進(jìn)行試驗.
實(shí)驗用菲，C14H10，純度≥98%(HPLC), 為色譜純，購自美國Sigma Aldrich化學(xué)品公司;其他試劑均為分析純.全部玻璃器具使用前經(jīng)過(guò)高價(jià)酸液沖洗之后由氣相色譜分析從而保證不會(huì )產(chǎn)生干擾，同時(shí)操作過(guò)程中實(shí)驗員嚴格遵守操作規定.菲溶液配制使用的移液槍經(jīng)中國計量科學(xué)研究院校準，各個(gè)濃度組第一次實(shí)驗前由氣相色譜檢測確保濃度配制精準.在3組空白實(shí)驗中加入內標菲-d10，96 h后測定其回收率，結果顯示，菲-d10的回收率為74.3%~89.6%，滿(mǎn)足70%~130%的US EPA(1985)公布的回收率要求，證明本實(shí)驗結果可靠準確.
2.2 實(shí)驗方法
急性實(shí)驗按照美國材料與試驗協(xié)會(huì )(American Society for Testing and Materials，ASTM)標準方法執行，設空白對照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對照組、濃度組，每組3個(gè)重復.溞類(lèi)急性毒理學(xué)實(shí)驗進(jìn)行48 h，其余8種水生生物要進(jìn)行96 h;相關(guān)信息見(jiàn)表 1.
慢性實(shí)驗根據菲對錦鯉、泥鰍和大型溞的急性毒性試驗結果，空白對照組、助溶劑(二甲基亞砜, DMSO)對照組、濃度組，每組3個(gè)重復.其中最高濃度組低于急性毒性L(fǎng)C50值.采用靜態(tài)更新試液法，每隔1 d更新1次受試液并喂食.錦鯉、泥鰍慢性毒理學(xué)實(shí)驗進(jìn)行至少28 d以上，溞類(lèi)至少21 d以上，具體實(shí)驗濃度設置如下：錦鯉為0.00、0.35、0.46、0.60、0.78、1.01和1.32 mg·L-1 PHE;泥鰍為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1PHE;大型溞為0.00、0.42、0.55、0.72、0.94、1.22和1.59 mg·L-1 PHE.試驗中每天記錄錦鯉和泥鰍體長(cháng)、體重等生長(cháng)指標，記錄大型蚤第一窩產(chǎn)卵時(shí)間、數量，總產(chǎn)卵窩數量和總產(chǎn)卵數量等.
2.3 數據搜集與分析
通過(guò)US EPA ECOTOX毒性數據庫、ELSEVIER數據庫和CNKI數據庫等進(jìn)行數據搜集.篩選原則如下：①測試信息不完全、信息保密、受權限或其他原因不能傳播的數據不得使用;②具有高度揮發(fā)性、易水解或降解的物質(zhì)，一般只有流水式試驗的結果可以使用;③測試終點(diǎn)為慢性NOEC或LOEC值，優(yōu)先使用NOEC值;④一些有問(wèn)題或有疑點(diǎn)的數據(如：沒(méi)有設立對照組、試驗生物曾經(jīng)暴露于污染物、試驗設計不科學(xué)的數據)均不能采用.
另外，在獲得毒性數據后，首先應該對數據或對數轉換的毒性數據進(jìn)行正態(tài)分布檢驗，一般采用K-S檢驗或者t檢驗.本研究選用K-S檢驗(Two-sample Kolmogorov-Smirnov)PHE美國水生生物毒性數據(表 2)的正態(tài)分布，結果顯示，p=0.08>0.05，認為美國水生生物毒性數據對PHE毒性敏感的總體分布基本相同，符合正態(tài)分布.
EC/LCx計算方法：EC/LCx和95%置信區間采用概率單位直線(xiàn)回歸法計算，急性毒性試驗x為50，慢性毒性實(shí)驗x為10.試驗開(kāi)始和結束后溶液中PHE濃度檢測結果顯示實(shí)測和名義濃度比率在91.68%~103.47%之間，即濃度差異在20%以?xún)�，符合測試標準對濃度的要求(Aldenberg et al., 2000)，因此本文中濃度采用名義濃度計算EC/LCx.
3 結果與分析 3.1 急性毒性實(shí)驗
9種本土水生生物的急性毒性試驗結果見(jiàn)表 3，空白對照組和助溶劑對照組均未出現死亡現象.結果顯示水螅屬的96 h LC50為0.096 mg·L-1，水螅屬對PHE暴露的敏感性最高，其次是大型溞、搖蚊幼蟲(chóng)、麥穗魚(yú)、澤蛙蝌蚪、霍甫水絲蚓、青蝦和錦鯉，對PHE最不敏感的是泥鰍，其96 h LC50為3.684 mg·L-1.
本文也進(jìn)行了PHE對美國水生生物毒性的對比，前人研究發(fā)現藍鰓太陽(yáng)魚(yú)、虹鱒和大鱗大麻哈魚(yú)的96 h LC50為0.234、0.375和0.478 mg·L-1 PHE，這和本文的試驗結果比較接近.同時(shí)本文研究得到的浮游甲殼類(lèi)水生生物大型溞96 h LC50為0.275 mg·L-1，這與前人研究的另外一種浮游甲殼類(lèi)生物蚤狀溞(0.350 mg·L-1)也極為接近.本研究中本土底棲甲殼類(lèi)生物青蝦96 h LC50為1.079 mg·L-1，而美國底棲甲殼類(lèi)生物俄勒岡蝦96 h LC50為0.027 mg·L-1，兩者之間相差了40倍左右;環(huán)節動(dòng)物之間同樣存在著(zhù)較顯著(zhù)差異，本土霍甫水絲蚓96 h LC50為0.799 mg·L-1，美國夾雜帶絲蚓對PHE毒性更加敏感，96 h LC50為0.419 mg·L-1.由于缺乏相應的毒性數據，因此本文未進(jìn)行昆蟲(chóng)類(lèi)及兩棲類(lèi)對比.
3.2 慢性毒性數據
對于慢性毒性數據(表 4)，Call等報道稱(chēng)大型溞的存活率21 d NOEC為0.163 mg·L-1，與本試驗中大型溞總繁殖數量的21 d EC10(0.060 mg·L-1)處在一個(gè)數量級之內.同時(shí)所有試驗濃度組中均未出現死亡現象，表中可見(jiàn)大型溞對PHE暴露的繁殖總數試驗終點(diǎn)要比存活率更為敏感.本試驗中錦鯉和泥鰍生長(cháng)的28 d EC10分別為0.435和0.540 mg·L-1 PHE，前人研究發(fā)現PHE對虹鱒生長(cháng)的28 d NOEC分別為0.66 mg·L-1.在慢性毒性試驗中，大型溞仍然是對PHE暴露最敏感的物種.
3.3 基于本土與美國生物毒性數據擬合SSD曲線(xiàn)比較
Davies等提出“靈活使用毒性數據”的設想，即使用一個(gè)地區的生物毒性數據去進(jìn)行另一個(gè)區域的生態(tài)風(fēng)險評估.不過(guò)該設想提出后受到多方面質(zhì)疑，因為不同地區水溫、水中溶解氧濃度不同，而且不同種類(lèi)生物對同一有害物質(zhì)的敏感性也存在差異(Hose et al., 2007).本研究針對本土(表 2)與美國(表 3)生物毒性數據擬合的SSD曲線(xiàn)進(jìn)行比較，從而初步探索“靈活使用毒性數據”設想的可行性.由于慢性數據相對匱乏，因此本研究?jì)H使用急性毒性數據.本研究針對PHE毒性數據共擬合出3條SSD曲線(xiàn)，分別是本土生物毒性數據(黑線(xiàn))、美國生物毒性數據(紅線(xiàn))及本土+美國生物全部毒性數據(藍線(xiàn)).如圖 1所示，由左向右分別是美國數據、總體數據及本土數據，這意味著(zhù)美國相對于本土生物對PHE暴露表現出更加敏感的趨勢.經(jīng)過(guò)計算，3條曲線(xiàn)的HC5值分別是0.0780、0.0785及0.0854 mg·L-1.
數學(xué)統計檢驗中，two-sample Kolmogorov-Smirnov(K-S test)檢驗通常用于推斷兩樣本分別代表的兩總體分布是否相同.因此借助Kolmogorov-Smirnov檢驗分析本土與美國毒性數據二者之間是否存在顯著(zhù)性差異具有十分重要的學(xué)術(shù)價(jià)值：①如果兩者有顯著(zhù)性差異，那么驗證了我們學(xué)術(shù)界有必要進(jìn)行選取本土水生生物進(jìn)行相關(guān)的基準閾值研究;②如果兩者無(wú)顯著(zhù)性差異，那么證明在本土基準閾值推導過(guò)程中可以采用已經(jīng)報道過(guò)的美國水生生物毒性數據，從而減少重復的人力物力投入及受試生物的消耗.K-S結果如下：(Ks = 1.342, n1 = 10, n2 = 9, p = 0.08).p =0.08>0.05，按a=0.05水準，認為兩組數據對PHE毒性敏感的總體分布基本相同，兩組數據之間不存在顯著(zhù)性差異性(圖 1).
3.4 PHE水生生物水質(zhì)基準閾值推導
本文采用USEPA“指南”推薦的SSR方法對基于實(shí)測數據的PHE水生生物基準閾值進(jìn)行了計算，本土物種SMAV值和GMAV值排序見(jiàn)表 5，計算得出我國PHE的急性基準閾值CMC為0.033 mg·L-1，該值是由FAV(0.066 mg·L-1)除以評價(jià)因子(通常取值為2)所得.由于我國PHE慢性毒性數據稀少，本文采用“指南”推薦的FCV=FAV/FACR方法計算FCV值，FACR(5.51)是通過(guò)3種水生生物SACR的幾何平均值算出(本研究中大型溞、錦鯉和泥鰍的SACR分別是4.18、5.86和6.82)，最終得出FCV值為0.012 mg·L-1，而FCV值遠遠低于PHE植物毒性值(浮萍，0.658 mg·L-1)，因此能對植物起到保護作用.“指南”指出，CCC是由FCV、FPV和FRV中較小的值確定.由于我國相應的MPC和BCF值缺乏，而且植物的敏感性通常遠遠低于動(dòng)物，因此在很多情況下可以不計算FRV，直接用FCV值計算CCC.最終得出我國PHE的慢性基準閾值CCC為0.012 mg·L-1.
4 討論
前人研究報道大型溞的96 h LC50為0.230 mg·L-1，這與本研究的結果(0.275 mg·L-1)相似.前人通過(guò)物種敏感性比較得出麥穗魚(yú)對有機污染物特別是殺蟲(chóng)劑的敏感性較高，Yan等通過(guò)毒性試驗發(fā)現麥穗魚(yú)對溴代阻燃劑(TBBPA)的敏感性較高，因此，可以初步判斷本土水生生物中，魚(yú)類(lèi)中的麥穗可能是一種對有機化合物相對敏感的物種.Edsall等研究發(fā)現虹鱒魚(yú)苗對有機氯農藥(OCPs)較為敏感.另外，Wang等通過(guò)毒性試驗發(fā)現，泥鰍對廣譜抗菌劑三氯生(TCS)的敏感性較高，但本文的試驗結果發(fā)現泥鰍對PHE的敏感性最低，這可能是由于不同化合物對水體底層的水生生物產(chǎn)生毒性影響不盡相同導致的(Paolo et al., 2004).
由于美國生物毒性數據不包括昆蟲(chóng)和兩棲類(lèi)水生生物，將本土昆蟲(chóng)類(lèi)搖蚊幼蟲(chóng)、兩棲類(lèi)動(dòng)物澤蛙蝌蚪的毒性數據去除之后再次進(jìn)行K-S檢驗，p=0.13>0.05(Ks= 0.830, n1 = 8, n2= 7).因此，這表明PHE本土與美國生物的敏感性不存在顯著(zhù)性差異，這表明直接使用美國水生生物毒性數據來(lái)推導我國本土水生生物基準閾值是可行的，這與前人研究結果相符.
另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及環(huán)保部《淡水水生生物水質(zhì)基準制定技術(shù)指南》推薦的敏感度分布(SSD)法求出HC5值，分別是0.102和0.0854 mg·L-1.因此當評價(jià)因子確定為2時(shí)，這兩種SSD曲線(xiàn)計算得出的CMC分別為0.051和0.0427 mg·L-1，可以看出，與US EPA“指南”中推薦的SSR法求出的CMC(0.033 mg·L-1)相比較同在一個(gè)數量級.
5 結論
1) 采用US EPA“指南”推薦的方法對菲本土水生生物急性基準閾值(CMC)和慢性基準閾值(CCC)進(jìn)行了推導，分別為0.033 mg·L-1和0.012 mg·L-1;另外，借助荷蘭RIVM公布的ETX2.0軟件及歐盟推薦的SSD方法進(jìn)行基準閾值的驗證，結果顯示兩種方法所得閾值與SSR法處在同一數量級.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
2) 本土與美國物種之間敏感性不存在顯著(zhù)性差異，這表明存在使用美國水生生物毒性數據來(lái)推導我國菲水生生物基準閾值的可能性.
