分析城市污水微生物脫氮效率與活性

　　1 引言(Introduction)

　　人類(lèi)活動(dòng)帶來(lái)的水體富營(yíng)養化的問(wèn)題(馬經(jīng)安等，2002)，使人們越來(lái)越關(guān)注氮和磷(蔡順智等，2016)在自然界中的遷移轉化，尤其是氮的去除率已經(jīng)成為衡量某一自然或人工系統脫氮效果的重要指標.污水處理廠(chǎng)在設計之初，就將利于硝化和反硝化作用的發(fā)生作為重要的設計指標(傅鋼等，2004).但是脫氮效率不穩定，脫氮效果不達標的現象在水處理過(guò)程中經(jīng)常發(fā)生(張雷等，2014).脫氮過(guò)程，即氨氮經(jīng)過(guò)硝化作用生成硝酸氮和亞硝酸氮，硝酸氮和亞硝酸氮再經(jīng)過(guò)反硝化過(guò)程被轉化為氮氣進(jìn)入空氣，最終達到脫氮的目的的過(guò)程(Ye et al., 2001).通常所說(shuō)的氮去除效率不達標只是表面現象，實(shí)質(zhì)上，是活性污泥沒(méi)有達到期望的處理能力.在自然水體或復雜水工構筑物中，很難通過(guò)簡(jiǎn)單的氮含量測定來(lái)描述該生態(tài)或生物系統的脫氮性能(盧陽(yáng)陽(yáng)，2013)，因此，從活性污泥入手建立一種檢測方法或者指標來(lái)評價(jià)微生物的脫氮性能，并能根據其變化來(lái)反饋污水處理過(guò)程中的脫氮情況，將對污水處理廠(chǎng)脫氮效能的準確把握與精準調控意義重大.

　　基于同位素分餾效應(Banner et al., 1995)，穩定同位素檢測為水中氮素的遷移轉化過(guò)程(Hoefs et al., 1997)研究提供了技術(shù)方法.Handley和Raven(1992)在1992年，就將同位素分餾效應用于解釋硝化反硝化過(guò)程中的物質(zhì)遷移轉化，Barford等(1999)，Karen等(2003)和Lehmann(2004)也對此開(kāi)展了進(jìn)一步研究，得出在硝化與反硝化過(guò)程中均存在著(zhù)明顯的同位素分餾效應，使得液相中無(wú)機氮的氮同位素比值上升.隨著(zhù)活性污泥同化作用的發(fā)生，其δ15N值隨液相無(wú)機氮δ15N值的升高而升高.所以，脫氮效果不佳，就意味著(zhù)δ15N值下降.

　　為研究城市污水廠(chǎng)活性污泥的脫氮效果，實(shí)際中通常監測TN、NH4-N、NO3-N等指標，并結合MLSS、MLVSS、SS、SVI等指標來(lái)監測活性污泥生長(cháng)情況.這些指標只能單一的反映水質(zhì)或微生物的某一項變化，當城市污水廠(chǎng)出現脫氮問(wèn)題時(shí)，需要對水質(zhì)和污泥分別進(jìn)行監測才有可能找出問(wèn)題所在，這些指標不能很好地反映活性污泥中與脫氮相關(guān)的微生物群落狀況.然而，面對一些復雜的脫氮疑難問(wèn)題時(shí)，需結合微生物狀況分析，但這些方法一般費時(shí)費力，如凝膠電泳法用時(shí)達一周.針對這一問(wèn)題，本研究旨在開(kāi)發(fā)一種既能反映活性污泥的實(shí)際脫氮性能，又能表征活性污泥中與脫氮相關(guān)的的微生物群落狀況的檢測方法.本文利用瑞利分餾方程建立了關(guān)于活性污泥δ15N值與污水中無(wú)機氮的去除效率之間的關(guān)系模型(活性污泥脫氮效率模型)，該模型的核心就是通過(guò)活性污泥本身的δ15N值來(lái)預測其脫氮性能.為確定該模型中的相關(guān)參數，對某A2O工藝的污水處理廠(chǎng)進(jìn)行長(cháng)期監測，并應用于具有不同出水特性的污水處理廠(chǎng)，以證明該模型在不同無(wú)機氮組成情況下的適用性.最后，本文還設置了幾種典型工況，以證明該模型在不同工況下的適用性.該模型的建立，簡(jiǎn)化了對水處理系統復雜的布點(diǎn)監測程序，對污水處理廠(chǎng)的強化脫氮具有指導意義，為水處理系統脫氮性能評價(jià)提供了新的手段.本研究提出的檢測方法意在通過(guò)監測活性污泥的δ15N值，實(shí)現對污水廠(chǎng)脫氮效率的預測，同時(shí)表征活性污泥的脫氮活性.與常規監測方法不同，本方法只需取少量污泥，進(jìn)行一定的預處理后送檢即可計算出污泥脫氮效率及脫氮活性.該方法在污水處理廠(chǎng)的調試過(guò)程或分析脫氮問(wèn)題遇到瓶頸時(shí)，可以提供借鑒作用，具有一定的實(shí)用價(jià)值.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 樣品

　　本實(shí)驗所用樣品分別取自陜西省西安市第三、第四及第五污水處理廠(chǎng).西安市第三污水處理廠(chǎng)采用Orbal氧化溝工藝，轉碟曝氣，有效水深4.2 m，生物池總HRT為18 h，SRT為20 d.西安市第四污水處理廠(chǎng)采用內嵌氧化溝倒置A2O二級生物處理工藝，微孔曝氣，有效水深6.0 m，HRT為11 h (其中缺氧池1.98 h，厭氧池1.0 h，內嵌氧化溝的好氧池7.94 h)，SRT為24 d.第五污水處理廠(chǎng)一期污水處理規模20×104 m3·d-1，采用厭氧/缺氧/好氧(A2O)二級生物處理工藝，3個(gè)生物池的水力停留時(shí)間分別為2 h、5.5 h、8.9 h(金鵬康等，2014).其中，第五污水處理廠(chǎng)好氧池內嵌填料氧化溝，以提高氧化能力，系統正常運行過(guò)程中污泥濃度約為(4200±300), 污泥齡為20 d，污泥回流比為100%±5%，混合液回流比200%±10%.

　　3個(gè)污水廠(chǎng)的生物池進(jìn)水、生物池出水每隔3~5 d取樣1次，每次取樣100 mL.水樣經(jīng)0.45 μm膜過(guò)濾后測定常規指標;從濾膜上取少量(約1 g)活性污泥于10 mL離心管中，加入7 mL 10%的HCl溶液，振蕩反應，除去樣品中的碳酸鹽，將該混合液15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;再加入7 mL超純水、振蕩、洗脫殘余的HCl，將混合液冷凍干燥，15000 r·min-1離心1 min，棄去上清液;洗脫過(guò)程重復兩遍，離心所得污泥樣品經(jīng)冷凍、干燥、研磨后，測定δ15N值.

　　2.2 測試方法

　　水樣常規指標化學(xué)需氧量(COD)、總氮(TN)、氨氮(NH4-N)、硝酸鹽氮(NO3-N)、亞硝酸鹽氮(NO2-N)測定方法分別采用重鉻酸鉀法、過(guò)硫酸鉀-紫外分光光度法、納氏比色法、紫外分光光度法和N-(1-萘基)-乙二胺光度法，具體操作步驟見(jiàn)國家標準(國家環(huán)境保護總局，2002).pH采用上海大普PHS-3C型精密酸度計測定.

　　活性污泥TN的測定需要在水常規指標測定方法的基礎上進(jìn)行性預處理，方法如下：稱(chēng)取1.000 g(精確到0.001)左右樣品，將要測定的樣品稀釋到100 mL，在超聲波里面震動(dòng)30 min，再對樣品進(jìn)行離心處理(或用水沖洗過(guò)的中速濾紙過(guò)濾，棄去初濾液20 mL).取上清液5~15 mL按與校準曲線(xiàn)相同的步驟測量吸光度.

　　冷凍干燥后的活性污泥樣品使用EAS vario PYRO元素分析儀-Isoprime 100同位素比值質(zhì)譜儀聯(lián)機測定δ15N.樣品的δ15N同位素比值用樣品(Rsmp)和標準物質(zhì)(Rstd)的同位素比值(R)(15N/14N)表示(Yamada et al., 2009), 即：

(1)

　　儀器采用的N參考標準為δ15Nair, 國際原子能機構認定的咖啡因為標準品，磺胺為實(shí)驗室標準物質(zhì)，該方法測定15N的標準偏差為±0.3‰.

　　活性污泥樣品采用低溫保存，然后送樣至基因測序公司委托測序.測序沿用高通量基本測序流程，經(jīng)DNA提取、PCR擴增、Miseq高通量測序等步驟.DNA提取采用土壤DNA提取方法，高通量測序通過(guò)IlluminaMise體系完成.所得結果進(jìn)行過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列，對優(yōu)化序列在97%相似度水平進(jìn)行OTU聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析，分析樣品的多樣性以及群落結構(冷璐等，2015).

　　3 結果與討論(Results and discussion)3.1 活性污泥δ15N與無(wú)機氮含量關(guān)系模型的建立

　　為建立活性污泥δ15N與水中無(wú)機氮去除效率的關(guān)系模型.首先，用瑞利分餾方程(Mariotti et al., 1981)來(lái)表示水中無(wú)機氮同位素組成與脫氮過(guò)程的千分富集因子的關(guān)系：

(2)

　　式中，f表示某時(shí)刻，未反應的無(wú)機氮占反應前總無(wú)機氮的比例;ε表示千分富集因子，與同位素分餾系數α的關(guān)系為α=1+ε/1000;RA表示某時(shí)刻，未反應無(wú)機氮的15N/14N值;RA0表示f=1時(shí)，無(wú)機氮的15N/14N值.

　　如圖 1所示，氨化過(guò)程中，同位素富集不明顯(Koba et al., 1998);在亞硝化作用、硝化作用和反硝化作用中，微生物優(yōu)先利用質(zhì)量較輕的14N(Onodera et al., 2015)，硝化過(guò)程的千分富集因子高達29.4‰ ± 2.4‰，而含有較重同位素的分子被富集在液相的含氮化合物中;在活性污泥同化無(wú)機氮的過(guò)程中，活性污泥優(yōu)先利用質(zhì)量較輕的14N.盡管如此，當活性污泥的生長(cháng)速率一定時(shí)，雖然活性污泥的同化作用存在著(zhù)同位素分餾現象，但是活性污泥與污水中無(wú)機氮的氮同位素組成比例即分餾系數α為常數(Valero et al., 2007).故活性污泥的RM0和無(wú)機氮的RA0之比等于硝化過(guò)程中任意時(shí)刻活性污泥的RM和無(wú)機氮的RA之比，其中RM0與RA0對應，表示f=1時(shí)，活性污泥和水中無(wú)機氮的15N/14N值，RM與RA表示脫氮過(guò)程任意時(shí)刻活性污泥和無(wú)機氮的15N/14N值，即：

　　圖 1氮的遷移轉化路線(xiàn)及其對δ15N值的影響

(3)

　　根據式(1)(2)(3)，剩余無(wú)機氮的占比與脫氮過(guò)程中活性污泥的δ15N的關(guān)系可表示為：

(4)

　　因為，當x≪1時(shí)，ln(x+1)≈x，故式(4)可化為：

(5)

　　此時(shí)，水中剩余無(wú)機氮的占比就可以表示為固相中活性污泥的δ15NM0的函數，其中，ε和δ15NM0為常數;剩余無(wú)機氮占脫氮反應發(fā)生前無(wú)機氮的比例f由[NH4-N+NOx-N]出水/[NH4-N+NOx-N]進(jìn)水定義.

　　活性污泥脫氮效率P即為：

(6)

　　該模型即為活性污泥脫氮效率模型.

　　本研究認為活性污泥的增長(cháng)速率維持恒定.參數ε和δ15NM0由公式(6)確定.利用觀(guān)測到的P與δ15NM，在Microsoft-Excel規劃求解下利用非線(xiàn)性方法得出參數ε和δ15NM0的值，目標函數為計算得出的P與相應的實(shí)際觀(guān)測值的方差，當方差達到最小值時(shí)，即得到參數ε和δ15NM0的取值.

　　當進(jìn)水無(wú)機氮含量已知時(shí)，可推導出無(wú)機氮的去除量方程.進(jìn)水無(wú)機氮負荷用c0×Q表示，c0表示進(jìn)水無(wú)機氮濃度(mg·L-1), Q表示系統進(jìn)水量(m3·d-1)，無(wú)機氮去除量W(t·d-1)可以表示為W=[(1-f)]c0×Q×10-6，即:

(7)

　　該模型即為活性污泥脫氮量模型.

　　3.2 參數計算

　　為獲得式(6)的模型參數，本研究對西安市第五污水處理廠(chǎng)二級生物處理進(jìn)出水進(jìn)行了長(cháng)期監測.二級處理過(guò)程進(jìn)出水的無(wú)機氮(NH4-N、NO3-N和NO2-N)濃度(圖 2).其中，TN的進(jìn)出水濃度分別為(69.18±7.97) mg·L-1和(15.25±6.31) mg·L-1，NH4-N的進(jìn)出水濃度分別為(40.68±4.96) mg·L-1和(12.63±8.15) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的出水濃度分別為(1.07±0.98) mg·L-1和(0.08±0.1) mg·L-1，NO3-N和NO2-N的進(jìn)水濃度極低，在圖中未作表示.檢測到的NO3-N和NO2-N濃度遠低于NH4-N的去除量，這表明污水中的反硝化反應速率很快，屬硝化作用限制因素.

　　圖 2生物池進(jìn)出水水質(zhì)

　　污泥的δ15N值與無(wú)機氮去除率的關(guān)系見(jiàn)圖 3.其中，無(wú)機氮的去除效率為67.58%±22.83%，污泥的δ15N值為8.06±2.00.從圖 3中可以看出污泥δ15N值與無(wú)機氮去除率具有極強的相關(guān)性(r=0.893，p<0.001).故利用本文3.1節建立的模型(式(6))，將圖 3數據在Microsoft-Excel規劃求解下利用非線(xiàn)性方法得出參數ε和δ15NM0的值，目標函數為計算得出的f與相應的實(shí)際觀(guān)測值的方差，當方差達到最小值時(shí)，取得到參數ε和δ15NM0的值，計算結果為ε=-3.53‰，δ15NM0=3.55‰.已經(jīng)有實(shí)驗表明，在海洋環(huán)境下，浮游生物的δ15N值與NO3-N濃度之間的ε值介于-2.5‰到-5‰之間(Wada et al., 1980)，NO3-N中的δ15N值與NO2-N濃度之間的ε值介于-3‰到-9‰之間(Sigman et al., 2001).本文得到的ε值也處于上述范圍之內，計算結果合理.

　　圖 3無(wú)機氮去除率與δ15N關(guān)系

　　3.3 參數驗證

　　因為西安市第五污水廠(chǎng)生物池出水無(wú)機氮中95%為氨氮(硝化限制作用)，為驗證3.2節所得參數在不同無(wú)機氮組成情況下的適用性，本文挑選了出水無(wú)機氮中高硝態(tài)氮含量(反硝化限制作用)和硝態(tài)氮與氨氮含量相當(氨化限制作用)的西安市第三、第四污水處理廠(chǎng)進(jìn)行參數驗證.

　　西安市第三、第四污水處理廠(chǎng)生物池進(jìn)出水水質(zhì)特性如表 1所示.將測得的二沉池進(jìn)水中活性污泥的δ15N、ε及δ15NM0帶入式(6)進(jìn)行無(wú)機氮去除效率的預測并與實(shí)際測得的無(wú)機氮去除率進(jìn)行相關(guān)性分析，結果如圖 4所示.其中，圖 4a為西安市第三污水處理廠(chǎng)的預測結果與實(shí)際值的對比(r=0.857，p<0.001)，圖 4b為西安市的四污水處理廠(chǎng)的預測結果與實(shí)際值的對比(r=0.886，p<0.001).該結果表明，上文所得模型對具有不同水處理限制因素的污水處理廠(chǎng)均適用.

　　圖

　　圖 4西安市第三(a)、第四(b)污水處理廠(chǎng)無(wú)機氮去除率與δ15N的關(guān)系

　　3.4 模型應用

　　為進(jìn)一步研究活性污泥脫氮效率模型在不同工況下的適用性，本研究設置了3種(1#、2#、3#)不同工況的反應器.調節運行參數，使3個(gè)反應器具有不同的脫氮效率.本文對這三個(gè)反應器進(jìn)行了長(cháng)期觀(guān)測，測得3個(gè)反應器的實(shí)際去除效率分別為94.54%、74.47%和23%;活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰.測定每個(gè)循環(huán)的進(jìn)出水無(wú)機氮濃度、反應器中活性污泥的δ15N值、進(jìn)水量Q以及模型參數，分別帶入評價(jià)模型(式(7))，對無(wú)機氮的實(shí)際去除量與預測去除量進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖 5所示.結果表明，1#(r=0.894，p<0.001)、2#(r=0.821，p<0.01)、3#(r=0.884，p<0.01)反應器均表現出顯著(zhù)相關(guān)，這說(shuō)明該模型的使用不受工況限制，對于不同工況下的水處理系統，均可以用式(7)從微生物角度評價(jià)活性污泥的脫氮性能.

　　圖 5不同工況下無(wú)機氮去除量預測值與實(shí)際值的對比

　　為進(jìn)一步研究活性污泥δ15N值與脫氮細菌多樣性及群落組成之間的關(guān)系，本文對脫氮效率分別為94.54%、74.47%和23%，活性污泥同位素水平為13.97‰、8.33‰和4.47‰的1#、2#和3#3個(gè)反應器中的細菌多樣性及豐富度進(jìn)行分析.

　　由表 2可以看出，3個(gè)反應器的序列條數和OUT數差異較大，分別在30875~25188和20244~22341之間.Chao、Shannon、ACE指數表明各反應器中的物種豐富度，其中，Shannon指數反映了基于物種數量的群落種類(lèi)多樣性，其變化趨勢與Chao和ACE指數的變化趨勢一致.總體來(lái)看，活性污泥的多樣性指數與活性污泥脫氮效率和δ15N值成反比，由此可見(jiàn)，活性污泥的脫氮能力和δ15N值對其多樣性指數有明顯影響，這部分影響可能與活性污泥中與脫氮作用相關(guān)的微生物有關(guān).具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　為驗證上述結論，對3個(gè)反應器內活性污泥的16S rDNA在門(mén)分類(lèi)層面上進(jìn)行對比，結果如圖 6所示.3種活性污泥樣品共檢測出12個(gè)菌門(mén)，其中，與脫氮過(guò)程相關(guān)的菌門(mén)包括Proteobacteria(圖中C色塊), Planctomycetes(圖中B色塊)和Nitrospirae(圖中A色塊)3個(gè)菌門(mén).大多數反硝化細菌、氨氧化細菌、亞硝酸鹽氧化細菌屬于Proteobacteria門(mén)(王春香等，2014)，厭氧氨氧化細菌屬于Planctomycetes門(mén)(曹雁等，2017)，部分亞硝酸鹽氧化細菌屬于Nitrospirae門(mén)(林婷，2012).隨著(zhù)活性污泥δ15N值的下降，3個(gè)菌門(mén)的相對百分比均呈下降趨勢.1#反應器的無(wú)機氮去除率為94.54%，δ15N為13.97‰，Proteobacteria門(mén)、Planctomycetes門(mén)和Nitrospirae門(mén)的相對百分比在3個(gè)反應器中最高，分別為31.12%、18.21%和0.57%，但其種群豐富度卻低于另外兩個(gè)反應器，這說(shuō)明與脫氮相關(guān)的功能性菌群的富集使得其他競爭力較弱的菌群數量減少，群落豐富度低，但無(wú)機氮去除效率高.2#反應器中3個(gè)與脫氮相關(guān)的菌門(mén)所占的相對百分比分別為25.42%、15.17%和0.44%，略低于1#反應器，但種群豐富度卻大于1#反應器.這解釋了2#反應器無(wú)機氮去除效率(74.47%)和δ15N(8.33‰)低于1#反應器的內因，即與脫氮相關(guān)的功能性菌群比例下降，原本競爭力較弱的菌群種類(lèi)增多，與功能性菌群爭奪營(yíng)養物質(zhì)，導致2#反應器中污泥脫氮活性較1#反應器低.3#反應器中Proteobacteria門(mén)占12.83%、Planctomycetes門(mén)8.44%、Nitrospirae門(mén)0.15%，在3個(gè)反應器中占比最低，因此其無(wú)機氮去除效率(23%)和δ15N(4.47‰)水平也最低，活性污泥脫氮活性的降低也導致了其他種類(lèi)微生物增多，種群豐富度大幅上升.

　　圖 6不同工況群落組成相對百分比

　　綜上，活性污泥δ15N值越大，其脫氮性能越強，與脫氮作用相關(guān)的細菌占據主導地位，其種群豐富度越低;活性污泥δ15N值越小，其脫氮性能越差，與脫氮作用相關(guān)的細菌喪失了其主導作用，種群豐富度增高.

　　4 結論(Conclusions)

　　1) 建立了污泥脫氮性能評價(jià)模型，模型描述了在活性污泥持續生長(cháng)的硝化反硝化系統中，活性污泥δ15N值與無(wú)機氮去除效率之間的相關(guān)關(guān)系.

　　2) 該模型參數適用于具有不同無(wú)機氮組成和不同工況的活性污泥處理系統.實(shí)現了通過(guò)監測活性污泥δ15N值，就能夠準確反饋出生物系統的脫氮能力，為污水廠(chǎng)脫氮問(wèn)題分析提供了新的方法和思路.

　　3)δ15N值的檢測不僅可以用于模型計算得出活性污泥無(wú)機氮去除效率，還可以表征活性污泥中微生物的脫氮活性。(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：孟妮娜)