氟喹諾酮對垂直流人工濕地性能及微生物群落有何影響

　　抗生素是一類(lèi)在低濃度下就能選擇性抑制某些生物生命活動(dòng)的微生物次級代謝產(chǎn)物及其化學(xué)合成或半合成的衍生物(衛生學(xué)大辭典).基于其良好的抑菌效果及生長(cháng)促進(jìn)作用, 該類(lèi)物質(zhì)在醫療、畜牧和水產(chǎn)養殖等行業(yè)得到了廣泛使用.但大量甚至過(guò)量使用及低代謝率也導致了其在環(huán)境中較高的檢出率.雖然環(huán)境中該類(lèi)物質(zhì)的檢出濃度一般為ng~μg級別, 但由此誘導產(chǎn)生的抗生素抗性基因及伴隨的基因水平轉移很可能使包括致病菌在內的其他微生物獲得抗生素抗性, 最終對人體健康和生態(tài)安全造成威脅.研究顯示, 抗生素的大量輸入還可使環(huán)境中原有的微生物群落發(fā)生轉變, 而微生物群落是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分, 其結構和功能的改變很可能對原有物質(zhì)循環(huán)過(guò)程產(chǎn)生影響.氟喹諾酮是應用十分廣泛的一類(lèi)廣譜抗生素, 通過(guò)抑制細菌體內的DNA復制達到抑菌目的, 對革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌均有較好抑制效果.良好的穩定性使其在沉積物、水生植物、河流湖泊、土壤中均呈現較高的檢出率和濃度.

　　人工濕地是一種模擬自然系統并經(jīng)過(guò)人工強化的凈水系統, 因成本低、管理容易而獲得了廣泛的關(guān)注和應用, 其在抗生素去除方面同樣表現良好. Liu等分別采用火山巖和沸石作為基質(zhì)的人工濕地去除獸用抗生素和抗性基因.結果顯示, 環(huán)丙沙星的去除率達到78%以上, 且以沸石作為基質(zhì)的濕地表現更佳. Huang等發(fā)現垂直流人工濕地可以去除養豬廢水中69%~99%的土霉素、四環(huán)素和金霉素且土壤中抗生素的含量與總氮和氨氮的去除效果存在負相關(guān)關(guān)系.但人工濕地對抗生素的去除效果還會(huì )受到濕地基質(zhì)類(lèi)型、植物種類(lèi)、pH、溶解氧和溫度等環(huán)境因素的影響.目前, 大多研究關(guān)注了濕地對抗生素及抗性基因的去除、散播和影響因素等, 對濕地中微生物群落在氟喹諾酮壓力下的變化關(guān)注不足.

　　目前, 關(guān)于抗生素對微生物群落的影響已有不少研究, 但大多研究采用的是單一抗生素或不同種類(lèi)抗生素的混合物, 針對同類(lèi)多種抗生素的研究較為欠缺.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 但其混合物在吸附過(guò)程中會(huì )產(chǎn)生競爭效應從而減小單個(gè)氟喹諾酮藥物的Kd值, 進(jìn)而影響到單個(gè)氟喹諾酮藥物的吸附性.因此, 氟喹諾酮混合物對微生物產(chǎn)生的影響可能與單個(gè)氟喹諾酮藥物存在差異.本實(shí)驗選擇環(huán)境中檢出率較高的3種氟喹諾酮：氧氟沙星(ofloxacin, OFL)、諾氟沙星(norfloxacin, NOR)和環(huán)丙沙星(ciprofloxacin, CIP)的混合物作為添加物, 研究了人工濕地凈化能力及微生物群落在其壓力下的變化, 以揭示該類(lèi)抗生素對人工濕地的潛在影響.

　　1 材料與方法1.1 實(shí)驗裝置及運行

　　本實(shí)驗中采用由PVC制成的圓柱形人工濕地實(shí)驗裝置(如圖 1), 裝置直徑為40 cm, 高為80 cm.柱體自下而上依次填充卵石(高約3 cm)、陶粒(粒徑為5~8 mm和3~6 mm約1:1混合; 高12 cm)、沸石(粒徑為3~6 mm; 高30 cm)、土壤與蛭石的混合物(體積比約1:1混合, 高15 cm).裝置最上層種植兩株美人蕉, 外圍有鋁箔包裹.

　　圖 1

1.進(jìn)水桶; 2.進(jìn)水管; 3.蠕動(dòng)泵; 4.美人蕉; 5.土蛭混合層; 6.沸石層; 7.陶粒層; 8.卵石層; 9.出水管; 箭頭所示為水流方向圖 1 人工濕地實(shí)驗裝置示意 Fig. 1 Constructed wetland used in this experiment

　　實(shí)驗進(jìn)水采用人工配水, 每10.0 L水中含有4.40 g葡萄糖, 0.77 g氯化銨, 0.24 g磷酸二氫鉀, 0.14 g二水氯化鈣, 0.20 g七水硫酸鎂, 0.45 g六水三氯化鐵, 4.00 g碳酸氫鈉, 由蠕動(dòng)泵實(shí)現連續進(jìn)水, 每日進(jìn)水量為9.2 L, 水力停留時(shí)間約為39 h.裝置前期運行3個(gè)月以構建穩定的系統及微生物體系, 之后開(kāi)始在進(jìn)水中添加抗生素, 使3種抗生素在進(jìn)水中的濃度分別為氧氟沙星100 μg·L-1、諾氟沙星50 μg·L-1、環(huán)丙沙星50 μg·L-1.氧氟沙星(純度99%)、諾氟沙星(純度99%)、環(huán)丙沙星(純度≥98%)均購買(mǎi)于上海源葉生物科技有限公司, 配水所用其他試劑均為分析純.抗生素儲備液用含有0.2%乙酸的去離子水于棕色瓶中分別配置并存于冰箱中, 每月更新一次.進(jìn)水中添加抗生素的時(shí)間為2017年4~6月.

　　1.2 水質(zhì)指標測定

　　本實(shí)驗中, 進(jìn)出水的COD、氨氮、TP濃度每3 d測定一次, COD濃度測定采用快速消解分光光度法, 氨氮濃度采用納氏試劑分光光度法, TP濃度采用鉬酸銨分光光度法.出水抗生素濃度每周測定一次, 參考文獻[25]采用UPLC-MS/MS完成.

　　1.3 16S rRNA測序分析

　　在未添加抗生素前(C組)和添加抗生素兩個(gè)月后(T組)分別取3份最上層基質(zhì)進(jìn)行16S rRNA測序分析, 每次取樣間隔1 d, 取樣深度為表面下4~5 cm.樣品中的DNA提取采用Fast DNA SPIN Kit For Soil(MP Biotechnology)試劑盒完成.采用引物338F和806R對V3-V4可變區進(jìn)行PCR擴增, 反應條件為95℃預變性3 min, 95℃變性0.5 min, 55℃退火0.5 min, 72℃延伸0.5 min, 循環(huán)27次, 并在72℃最終延伸5 min.擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測, 然后在Illumina MiSeq平臺完成測序分析.測序由美吉生物醫藥公司完成.測序結果按照97%的相似度進(jìn)行OTU分類(lèi), 采用RDP classfier進(jìn)行分類(lèi)學(xué)統計, 然后計算每組樣本的Shannon指數、Shannoneven指數和Chao1指數.采用非度量多維尺度分析(non-metric multidimensional scaling, NMDS)判斷兩組樣本整體差異.顯著(zhù)性水平為P < 0.05.

　　2 結果與討論2.1 人工濕地運行效果

　　系統進(jìn)出水COD、氨氮、TP的濃度變化如圖 2所示.整個(gè)實(shí)驗過(guò)程中, 氨氮去除率始終大于95.40%, 未受到抗生素的明顯影響. COD和TP的去除效果變化較為明顯.未添加抗生素階段, COD去除率大于97.88%;抗生素添加初期, 出水COD濃度未呈現較大變化, 但從添加后的第16 d開(kāi)始, 出水COD濃度開(kāi)始逐漸上升, 直至第34 d達到最大值120.4 mg·L-1, 去除率為70.94%.之后, 出水COD濃度逐漸下降直至實(shí)驗末期.對于TP, 未添加抗生素期間, TP去除率大于84.52%;添加抗生素后, 出水TP濃度呈現上升趨勢并伴隨較大幅度波動(dòng).綜上, 氟喹諾酮對人工濕地的凈化性能產(chǎn)生了負面影響且主要體現在COD和TP去除方面.本實(shí)驗中, 除有4周的出水中有抗生素檢出外, 其余出水中抗生素的濃度均低于檢出限, 因此, 垂直流人工濕地對氟喹諾酮具有良好的去除效果.

　　圖 2

圖 2 進(jìn)出水COD、氨氮、TP濃度曲線(xiàn)

　　類(lèi)似結果已有報道. Amorim等[26]研究氧氟沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星對好氧顆粒污泥SBR系統的影響時(shí)發(fā)現當進(jìn)水中添加抗生素后, 出水COD濃度和TP濃度呈現上升趨勢, 而氨氮濃度未受明顯影響. SBR添加氧氟沙星后, COD、氨氮和TP的去除效果與本實(shí)驗相似. Zheng等發(fā)現當諾氟沙星濃度為0~6 mg·L-1時(shí), SBR對COD和氨氮的去除效果保持穩定, 當諾氟沙星濃度上升至35 mg·L-1時(shí), COD和氨氮去除率由90.7%和94.1%下降至76.5%和73.6%.可見(jiàn), 氟喹諾酮會(huì )對工藝出水水質(zhì)產(chǎn)生消極影響.氟喹諾酮具有良好的吸附性, 可通過(guò)靜電作用力、氫鍵、疏水力等被有機質(zhì)、無(wú)機礦物顆粒強烈吸附, 在人工濕地、污水處理廠(chǎng), 吸附都是該類(lèi)抗生素的重要去除途徑.本實(shí)驗中, 土蛭混合層和其中的有機質(zhì)均具備良好的吸附性, 因此系統展現了良好的抗生素凈化能力.同時(shí), 基質(zhì)對氟喹諾酮的強烈吸附也對微生物產(chǎn)生了一定的保護作用, 避免了抗生素添加初期出水水質(zhì)的劇烈變化.隨著(zhù)添加時(shí)間的延長(cháng), 系統中抗生素的積累量逐漸上升, 其負面影響也逐漸顯現, 與之伴隨的便是出水COD濃度和TP濃度的上升.盡管氟喹諾酮是一類(lèi)廣譜抗生素, 但微生物亦可通過(guò)外排泵機制、改變細胞內的抗生素敏感部位、使抗生素失活等方式增加自身對抗生素的耐受性和適應性.值得注意的是, 某些抗生素還可以作為微生物代謝的碳源.另外, 微生物群落還可通過(guò)調整內部結構逐步適應抗生素的存在.這些原因都可能使系統的凈化性能在抗生素添加后期逐步恢復.因此, 雖然氟喹諾酮會(huì )對人工濕地的凈化能力產(chǎn)生影響, 但其可以隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)逐步恢復.

　　2.2 微生物群落變化2.2.1 微生物群落概況

　　測序后得到各分類(lèi)水平的微生物數目如圖 3所示, 樣本的Shannon指數、Shannoneven指數、Chao1指數如表 1所示.對比兩組結果發(fā)現, T組樣本的Chao1指數顯著(zhù)高于C組, 但Shannon指數和Shannoneven指數變化并不顯著(zhù)(P>0.05)(表 1). NMDS分析結果(如圖 4)顯示, 不同組樣本點(diǎn)間距離較大, 同組樣本點(diǎn)間距離較小, 兩組樣本點(diǎn)呈現明顯分離趨勢.可見(jiàn), 氟喹諾酮確實(shí)使系統中的微生物群落產(chǎn)生了轉變.

　　圖 3

圖 3 各分類(lèi)水平微生物數目 Fig. 3 Species numbers for each classification level

　　表 1 α多樣性指數1)

　　圖 4

圖 4 NMDS分析

　　2.2.2 門(mén)水平微生物群落變化

　　抗生素添加前后各樣本的門(mén)水平微生物群落構成如圖 5所示, 其中C組的優(yōu)勢種群為Proteobacteria (44.90%)、Actinobacteria (24.61%)、Chloroflexi (7.37%)、Acidobacteria (7.93%)、Bacteroidetes (4.37%), T組的優(yōu)勢種群為Proteobacteria (34.12%)、Actinobacteria (21.82%)、Firmicutes (10.55%)、Acidobacteria (8.31%)、Chloroflexi (7.99%)和Bacteroidetes (5.25%). Proteobacteria、Actinobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria與Bacteroidetes始終為優(yōu)勢種群, 其總豐度在C組和T組中分別占比89.17%、77.49%, 這與其他研究中的結果類(lèi)似.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 5

圖 5 門(mén)水平的群落構成

　　從圖 5中可看出, Proteobacteria的相對豐度明顯減少而Firmicutes的相對豐度明顯上升. Kim等研究恩諾沙星對人體腸道微生物群落影響時(shí)發(fā)現, 隨著(zhù)恩諾沙星濃度的增加, Proteobacteria和Bacteroidetes的比例逐漸減小, 而Firmicutes所占比例逐漸增加.本實(shí)驗所用的諾氟沙星和環(huán)丙沙星為恩諾沙星的生物降解中間體. Xiong等發(fā)現糞肥中的氟喹諾酮會(huì )對土壤中的Proteobacteria產(chǎn)生抑制, 且施用了含氟喹諾酮肥料的土壤中Firmicutes的豐度要高于對照組. Yan等發(fā)現氧氟沙星、磺胺甲唑可使人工濕地中Firmicutes的相對豐度隨抗生素濃度逐漸增加.可見(jiàn), 氟喹諾酮對Proteobacteria有抑制作用而對Firmicutes有促進(jìn)作用.在眾多水處理工藝中, Proteobacteria均是發(fā)揮重要功能的優(yōu)勢種群, 與系統凈化能力密切相關(guān), 因此本實(shí)驗中COD和TP凈化效果的下降很可能與Proteobacteria相對豐度的明顯下降有關(guān).

　　2.2.3 綱水平微生物群落變化

　　C組和T組各樣本綱水平的微生物群落構成如圖 6所示, 其中C組的優(yōu)勢種群是Actinobacteria (24.61%)、β-Proteobacteria (17.03%)、α-Proteobacteria (11.69%)、δ-Proteobacteria (8.84%)、Acidobacteria (7.93%)、γ-Proteobacteria (7.05%), T組的優(yōu)勢種群是Actinobacteria (21.82%)、α-Proteobacteria (12.53%)、β-Proteobacteria (8.36%)、Acidobacteria (8.31%)、δ-Proteobacteria (7.52%)和γ-Proteobacteria (5.65%).比較兩組的構成發(fā)現, 相對豐度大于5%的優(yōu)勢種群中, β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相對豐度變化較大(如圖 6).有研究顯示, 廢水中的四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)和喹諾酮類(lèi)抗生素與β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria之間存在負相關(guān)關(guān)系.另外, 當同樣具有苯環(huán)結構的三氯生進(jìn)入到水-沉積物系統中時(shí), β-Proteobacteria的相對豐度也發(fā)生了大幅下降.可見(jiàn), β-Proteobacteria對該類(lèi)物質(zhì)的出現比較敏感. β-Proteobacteria是Proteobacteria的重要組成部分, 其中含有大量可以實(shí)現有機物降解、脫氮除磷等功能的微生物, 因此其豐度的減小可能與出水COD濃度和TP濃度上升之間存在相關(guān)關(guān)系.與β-Proteobacteria的變化趨勢相反, Clostridia、Bacilli、Bacteroidia的相對豐度呈現了比較明顯的增加(如圖 6), 分別從C組的0.50%、1.85%、0.10%增加到了T組的4.21%、4.64%和2.56%.有報道稱(chēng), Clostridia和Bacilli在盤(pán)尼西林和土霉素污染環(huán)境中呈現出很高的豐度, 且四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)對Clostridia有選擇性?xún)?yōu)勢.因此, Clostridia和Bacilli可能與抗生素污染環(huán)境之間存在潛在聯(lián)系. Liao等還發(fā)現Bacteroidia中含有能夠降解環(huán)丙沙星的菌種.可見(jiàn), Clostridia、Bacilli和Bacteroidia對氟喹諾酮具有較強適應性.綜上, 氟喹諾酮對Clostridia、Bacilli和Bacteroidia具有選擇性?xún)?yōu)勢, 對β-Proteobacteria具有選擇性抑制作用.

　　圖 6

圖 6 綱水平的群落構成

　　2.2.4 屬水平微生物群落變化

　　本實(shí)驗中, C組和T組分別檢測到585個(gè)屬和670個(gè)屬, 其中551個(gè)屬為兩組共有, 其中42.65%、15.79%、9.44%、7.26%、5.26%的屬分別包含于Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Firmicutes、Chloroflexi.在屬的分類(lèi)水平上, C組的優(yōu)勢種群為Dechloromonas (8.56%)、Pseudarthrobacter (5.10%)、Pseudomonas(3.37%)、Skermanella (2.28%)、Nitrospira (2.03%), T組的優(yōu)勢種群為T(mén)richococcus (3.84%)、Tessaracoccus (3.83%)、Dechloromonas (3.16%)、Pseudomonas (3.15%)、Desulfovibrio (2.06%).兩組樣本中豐度前15位屬的Heatmap圖如圖 7所示, 從中可看出Dechloromonas(屬于Proteobacteria)、Pseudarthrobacter(屬于A(yíng)ctinobacteria)的豐度下降明顯, 而Trichococcus(屬于Firmicutes)、Tessaracoccus(屬于A(yíng)ctinobacteria)、Desulfovibrio(屬于Proteobacteria)的豐度則出現明顯上升, 因此群落中不同種類(lèi)的微生物在氟喹諾酮壓力下呈現了不同的豐度變化趨勢.其中, Dechloromonas可以還原高氯酸鹽, 是生物水處理系統中常見(jiàn)的聚磷菌, 因此該屬豐度的減小可能與出水TP濃度上升有關(guān).另一個(gè)豐度減小的屬Pseudarthrobacter中的部分菌種(如Pseudarthrobacter sulfonivorans strain Ar51)可在低溫下降解原油和多苯化合物, 但本實(shí)驗期間氣溫較高, 可能抑制了其對復雜有機物的適應能力. Trichococcus具有良好的抗生素適應性, Trichococcus flocculiformi更是在各類(lèi)抗生素環(huán)境中廣泛存在的一類(lèi)微生物, 因此該屬在氟喹諾酮的選擇性壓力下呈現了更高的豐度. Tessaracoccus是一類(lèi)兼性厭氧(除T. lubricantis外)的革蘭氏陽(yáng)性菌, 在活性污泥、海底沉積物、被油污染的含鹽土中均有被分離出來(lái)的菌株, 因此, 該屬對環(huán)境良好的適應能力使其未受到抗生素的負面影響. Desulfovibrio可以將有機物或者分子氫的氧化與硫酸鹽還原過(guò)程聯(lián)系起來(lái)生成硫化氫并從中獲得能量, 是嚴格厭氧菌.有報道顯示, 包括Desulfovibrio在內的多種硫酸鹽還原菌都可以受到環(huán)丙沙星的促進(jìn)作用, 這與本實(shí)驗中的結果類(lèi)似. Nitrosomonas和Nitrosospira是重要的氨氧化菌, 其豐度在前后兩組未出現較大變化, 這與出水氨氮濃度一直保持穩定狀態(tài)的結果相一致.

　　圖 7

圖 7 屬水平的Heatmap圖

　　3 結論

　　(1) 氟喹諾酮會(huì )對人工濕地凈化性能產(chǎn)生負面影響, 主要體現在對COD和TP的去除方面, 但其可以隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng)逐步恢復; 同時(shí)垂直流人工濕地對氟喹諾酮具有良好的凈化效果.

　　(2) 氟喹諾酮使人工濕地中的微生物群落發(fā)生了轉變. Shannon指數和Shannoneven指數無(wú)顯著(zhù)變化, Chao1指數顯著(zhù)增加; 群落結構也發(fā)生了明顯轉變.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué) 作者：李新慧)