1 引言
高效、穩定的亞硝化反應是運行SHARON、ANAMMOX、CANON等新型生物脫氮工藝的先決條件.本課題組的前期研究表明，培養具有亞硝化功能的完全自養型好氧顆粒污泥(簡(jiǎn)稱(chēng)“亞硝化顆粒污泥”)，有利于實(shí)現對氨氧化菌(AOB)的高度富集，以突破當前限制“亞硝化路線(xiàn)”的技術(shù)瓶頸.
作為實(shí)現污泥顆�；年P(guān)鍵步驟，胞外聚合物(EPS)的累積不僅是微生物適應外界環(huán)境變化、保障自身聚集生長(cháng)的必要條件，也是影響污泥形態(tài)結構與降解活性的重要因素.因此，建立環(huán)境因素、污泥性狀與EPS組成的相互關(guān)系，對完善、優(yōu)化現有污水生物處理理論與技術(shù)具有重大意義.值得注意的是，EPS的化學(xué)組成與提取方法、污泥種類(lèi)密切相關(guān).目前，國內外鮮有關(guān)于亞硝化顆粒污泥EPS組成特性的報道.因此，有必要選出合適的提取方法并對其EPS組成進(jìn)行分析.
本研究以異養型好氧顆粒污泥(AGS)、普通活性污泥(AS)和厭氧顆粒污泥(AnGS)為參照，分別考察離心法、加熱法、熱堿法、甲醛-NaOH法和甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥(GNS)中EPS組分的提取效果，以選出最佳方法，并利用蛋白質(zhì)(PN)/多糖(PS)含量測定、三維熒光(3D-EEMs)與傅里葉紅外(FT-IR)光譜等表征手段，比較分析GNS有別于其他污泥樣品的EPS組成特性，以期為探究完全自養型好氧顆粒污泥的形成機理與形態(tài)特征提供參考.
2 材料與方法
2.1 污泥樣品
本研究所選污泥樣品的種類(lèi)、來(lái)源與性質(zhì)如表 1所示.其中，AS是實(shí)驗室培養GNS和AGS的接種污泥.
表 1 4類(lèi)污泥樣品的來(lái)源與性質(zhì)
2.2 EPS的提取方法
2.2.1 樣品預處理
采用離心預處理去除污泥樣品液中的可溶性有機物.取20 mL污泥液，在4 ℃、10000 r·min-1條件下離心10 min，棄去上清液，并使固體重新懸浮于中性磷酸緩沖溶液(含2 mmol·L-1 Na3PO4、4 mmol·L-1 NaH2PO4、9 mmol·L-1 NaCl和1 mmol·L-1 KCl)中，重復上述操作1次，所得樣品待用.隨后，對所有顆粒污泥均進(jìn)行了超聲處理，即在冰水浴、功率35 W條件下，超聲4 min.
2.2.2 EPS的提取方法與流程
為保證研究結果與文獻報道的可比性，本文選擇了5種常用的EPS提取方法，并建立對照法，具體操作過(guò)程如圖 1所示.
圖 1 EPS提取方法的流程
2.3 EPS的組分分析
在本研究中，EPS總量是指PN與PS質(zhì)量濃度之和，單位為 mg·g-1(以VSS計).蛋白質(zhì)含量采用Lowry法測定，以牛血清蛋白作為標準物質(zhì).多糖濃度采用苯酚-硫酸法測定，以葡萄糖作為標準物質(zhì).PN、PS的測定結果取3次平均值.污泥濃度(VSS)采用標準重量法測定.EPS提取液中的總有機碳(TOC)采用耶拿元素分析儀(HT1300-microN/C型)測定，并作為表征污泥EPS總量的輔助性指標.
三維熒光(3D-EEMs)光譜測定步驟：以Milli-Q純水為空白，使用1 cm熒光池在Cary Eclipse熒光分光光度計的同步掃描模式下進(jìn)行分析.光電倍增管電壓(PMT)為500 V，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(cháng)(λEx)和發(fā)射波長(cháng)(λEm)分別為200~400 nm和200~600 nm，掃描間隔均為10 nm，掃描速度1200 nm·min-1，峰強度最大量程為1000 A.U..采用Origin 8.5繪制等高線(xiàn)圖.
傅里葉紅外(FT-IR)光譜測定步驟：將EPS提取液置于冷凍干燥機中24 h，對固體進(jìn)行仔細研磨，并按1 ∶ 100的質(zhì)量比與高純度KBr混合后壓片，使用Thermo傅里葉變換紅外光譜(SCIENTIFIC型)進(jìn)行分析.
3 結果
3.1 亞硝化顆粒污泥EPS的提取結果
如表 2所示，對于亞硝化顆粒污泥而言，各提取方法所獲得的EPS總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對照法.對參照污泥的提取結果也大體如此.
表 2 采用不同方法對4類(lèi)污泥樣品EPS的提取結果
作為顆粒污泥中重要的結構性組分，蛋白質(zhì)和多糖通�？梢哉嫉轿勰郋PS總量的70%以上.由圖 2可知，無(wú)論采用何種提取方法，亞硝化顆粒污泥EPS中PN/PS比值始終大于1.其中，離心法是一種較為溫和的提取方法，其結果僅代表松散結合的胞外聚合物(LB-EPS)含量，后者對污泥的絮凝、脫水性能有直接影響(Li et al., 2007;王紅武等，2004).相比之下，經(jīng)熱堿法處理后，污泥有明顯的破胞現象，提取液呈棕黃色，TOC濃度很高，大量蛋白質(zhì)的溶出導致PN/PS比值高達8.4.參照污泥的EPS提取過(guò)程也存在類(lèi)似現象，這與張麗麗等(2007)對好氧顆粒污泥EPS提取方法的研究結果一致.同樣使PN/PS比值偏高的還有加熱法，具體表現為對多糖的提取效果較差.如果預先投加適量甲醛，起到固定與緩沖作用，將有效降低高溫、強堿對細胞結構的破壞，使水相中DNA等胞內物質(zhì)含量與胞漿酶(G6PDH)活性均處于較低水平.在本研究中，甲醛-NaOH法對污泥EPS的提取量?jì)H次于熱堿法，且PN/PS比值與對照組結果接近.根據文獻報道，甲醛-NaOH法提取的DNA濃度在0.1~3.3 mg·g-1(以VSS計)，遠小于熱堿法和加熱法的對應值，但高于離心法的0.05~0.5 mg·g-1(以VSS計).本研究提出的甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥EPS的提取結果與甲醛-NaOH法相當，提取時(shí)間縮短了近60%，但甲醛-熱堿法對參照污泥中蛋白質(zhì)的提取效果并不理想.
圖 2 4類(lèi)污泥樣品EPS中蛋白質(zhì)與多糖的含量
由表 2可知，當采用相同的提取方法時(shí)，4類(lèi)污泥的EPS含量大體遵循：AGS>AS>AnGS>GNS.出于維持特殊結構的需要，好氧顆粒污泥的EPS以緊密結合的胞外聚合物(TB-EPS)為主，其總量遠高于活性污泥的水平.其次，當污泥從好氧轉至厭氧環(huán)境中，部分EPS將以碳源、能源的形式被消耗掉(鄒小玲等，2010)，因而，厭氧顆粒污泥的EPS總量不高，并含有較多的腐殖酸類(lèi)物質(zhì).相比之下，比生長(cháng)速率僅為0.32~0.76 d-1的AOB等自養菌常被認為不能產(chǎn)生充足的EPS，以保障其獨立完成顆�；^(guò)程.即使在穩定運行100 d以上的完全自養硝化顆粒污泥中，異養菌仍具有一定的活性，并對維持污泥結構的穩定起到積極作用(張子健等，2010).最近，戴昕(2014)利用PCR-DGGE、454高通量測序和qPCR等分子生物學(xué)手段證明，AGS形成過(guò)程中定向分泌的胞外蛋白質(zhì)主要來(lái)自高度富集的Zoogloea spp.菌株.而Wu等(2012)的研究也表明，將反應器進(jìn)水COD/NH4+-N控制在1~2之間，20 d內即可獲得成熟的硝化顆粒污泥，高比例的多糖成分對于生長(cháng)周期較長(cháng)、附著(zhù)能力較差的硝化細菌起到了很好的固定作用.本研究發(fā)現，亞硝化顆粒污泥的EPS組成也具有類(lèi)似特點(diǎn).當采用甲醛-NaOH法進(jìn)行提取時(shí)，GNS的PS/PN比例為0.77，遠高于其他污泥樣品.
3.2 亞硝化顆粒污泥EPS的三維熒光分析
在統一采用甲醛-NaOH法的前提下，對4類(lèi)污泥樣品的EPS進(jìn)行三維熒光光譜分析，結果如圖 3所示.依據Chen等(2003)總結的3D-EEMs圖譜分析方法，可以獲得熒光特征峰的相關(guān)參數，具體見(jiàn)表 3.從圖譜形狀與特征峰位置來(lái)看，亞硝化顆粒污泥與異養型好氧顆粒污泥的結果非常接近，強熒光峰均主要來(lái)自可溶性微生物代謝產(chǎn)物和芳香類(lèi)蛋白質(zhì)，這也體現了兩者在顆粒形態(tài)結構上的相似性.盡管普通活性污泥的EPS也含有同類(lèi)型的熒光峰，但峰強要低得多，這意味著(zhù)顆粒污泥具有比絮狀污泥更高的微生物活性和更多的結構性蛋白的研究結果表明，顆粒污泥較絮狀污泥含有更豐富的酪氨酸、色氨酸等芳香 類(lèi)蛋白，該類(lèi)物質(zhì)有利于促進(jìn)細胞聚集和增強顆粒的穩定性.另外，本研究選取的好氧顆粒污泥是以簡(jiǎn)單化合物為碳源和氮源.因此，好氧顆粒污泥EPS的3D-EEMs圖譜中并未找到厭氧顆粒污泥中常見(jiàn)的類(lèi)腐殖酸峰.Zhu等(2012)發(fā)現，在污泥顆�；^(guò)程中，類(lèi)腐殖酸峰的強度呈現先增強后減弱的變化趨勢，并認為除了進(jìn)水水質(zhì)的影響以外，顆粒污泥EPS中腐殖酸的含量與其成熟度存在一定的關(guān)聯(lián)性.
圖 3 4類(lèi)污泥樣品EPS的三維熒光圖譜 (等高線(xiàn)表征熒光強度)
表 3 污泥樣品EPS的熒光特性分析
3.3 亞硝化顆粒污泥EPS的傅里葉紅外分析
在相同前提下，對4類(lèi)污泥樣品的EPS進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結果如圖 4所示.波長(cháng)在1000 cm-1以?xún)鹊闹讣y區特征峰大多由含硫、磷的不飽和鍵發(fā)出，而蛋白質(zhì)、多糖等EPS組分主要集中于1000~1800 cm-1區間.其中，1070、1296 cm-1附近的特征峰分別由多個(gè)C—O不對稱(chēng)伸縮振動(dòng)和O—H變形振動(dòng)引起，均明確指向多糖組分.1454、1610和3430 cm-1則對應于蛋白質(zhì)中常見(jiàn)的C—OH、H—N—H和N—H等酰胺類(lèi)基團，1667 cm-1更是與蛋白質(zhì)二級結構Amide III密切相關(guān).
圖 4 4類(lèi)污泥樣品EPS的傅里葉紅外光譜圖
與3D-EEMs的結果類(lèi)似，亞硝化顆粒污泥EPS的紅外特征峰位置與異養好氧顆粒污泥基本一致，但前者的峰強更高.相比之下，普通活性污泥與厭氧顆粒污泥的峰型更為雜亂.這說(shuō)明污泥顆�；^(guò)程在對微生物種類(lèi)進(jìn)行選擇性“淘洗”的同時(shí)，也簡(jiǎn)化了胞外聚合物的組成.對于A(yíng)nGS而言，EPS中的腐殖酸會(huì )在一定程度上干擾PN與PS對應特征峰的定位.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結論
1)不同方法對亞硝化顆粒污泥EPS的提取總量遵循：熱堿法>甲醛-NaOH法>加熱法>甲醛-熱堿法>離心法>對照法.其中，甲醛-NaOH法能在有效保護細胞結構的同時(shí)，獲得較高的EPS提取效率，濃度值為(58.4±2.1)mg·g-1(以VSS計).耗時(shí)更短的甲醛-熱堿法對亞硝化顆粒污泥同樣適用，但其對參照污泥的提取結果并不理想.
2)在本研究中，亞硝化顆粒污泥的EPS總量最低，這可能與自養菌分泌EPS的能力較弱有關(guān).但在GNS的EPS組分中，PS/PN比值為0.77，遠高于以異養微生物為主的其他污泥樣品，豐富的多糖成分對于生長(cháng)周期較長(cháng)、附著(zhù)能力較差的氨氧化菌能起到較好的固定作用.
3)由3D-EEMs和FT-IR圖譜可知，亞硝化顆粒污泥EPS的熒光特征與異養型好氧顆粒污泥非常類(lèi)似，特征峰均主要來(lái)自可溶性微生物代謝產(chǎn)物(λEx/λEm=250~310 nm/320~380 nm)和芳香類(lèi)蛋白質(zhì)(λEx/λEm= 200~250 nm/280~380 nm).與普通活性污泥相比，亞硝化顆粒污泥具有更高的微生物活性和更豐富的結構性蛋白，且EPS組成也更為簡(jiǎn)單.
