1 引言
砷是一類(lèi)廣泛存在于土壤中的具有致癌作用的類(lèi)金屬元素，主要來(lái)源于含砷農藥、化肥的施用及含砷污水灌溉等.據雷鳴等(2008)的調查，湖南郴州、衡陽(yáng)等地稻田砷污染較嚴重，土壤砷含量最高達245 mg·kg-1，導致大米砷含量超標，造成嚴重的健康威脅和巨大的經(jīng)濟損失.同時(shí)，砷作為一種變價(jià)元素，不同價(jià)態(tài)毒性及生物有效性有較大差異，如三價(jià)砷生物毒性是五價(jià)砷的60~100倍.此外，水分可通過(guò)改變土壤氧化還原電位、鐵錳氧化物等變價(jià)元素的價(jià)態(tài)而影響砷的生物有效性及其環(huán)境風(fēng)險，如淹水導致As(Ⅴ)向As(Ⅲ)轉化，提高了土壤中As(Ⅲ)的含量;同時(shí)，土壤水分會(huì )影響水稻籽粒中砷含量，灌漿期后濕潤灌溉可顯著(zhù)降低糙米中砷含量.研究表明，稻田土壤水分含量可影響并改變土壤溶液及稻米中砷含量，而控制土壤水分含量是解決稻田土壤砷污染問(wèn)題的有效途徑之一，并揭示出水分是影響砷毒性的主要因素之一，尤其是在稻田土壤上.因此，需對二者作用關(guān)系進(jìn)行系統探討.
土壤酶是土壤的重要組成成分，土壤中所有生物化學(xué)過(guò)程的發(fā)生都得益于土壤酶的作用.酶促反應動(dòng)力學(xué)是研究酶催化反應速度及各種因素(如污染物等)影響的方法，其結果不僅可顯示土壤酶總量的高低，而且還可以反映酶與底物、重金屬污染物等之間結合的緊密程度和作用過(guò)程，從而能深入探討污染物與酶作用機理，故被認為是一種理想的研究手段.目前，國內外學(xué)者對砷的土壤酶效應進(jìn)行了研究，發(fā)現有激活、抑制和無(wú)關(guān)3種作用，如As(Ⅴ)會(huì )抑制堿性磷酸酶及芳基硫酸酯酶活性，而As(Ⅲ)則不敏感;砷能激活土壤脲酶活性.對不同水分下土壤酶作用機理的研究也有零星報道，如Zhang等(2009a;2009b)發(fā)現，土壤脫氫酶活性及酶促最大反應速度均隨水分含量升高而增加;高水分含量增強了磷酸酶與底物親和力，提高了最大反應速度;淹水對土壤脲酶動(dòng)力學(xué)參數無(wú)顯著(zhù)影響(雋英華等，2011).但目前對不同水分條件下砷與酶作用機理的研究則鮮見(jiàn)報道.因此，本文擬采用室內模擬培養試驗的方法，從酶動(dòng)力學(xué)角度研究水分對砷與土壤堿性磷酸酶關(guān)系的影響，揭示砷對堿性磷酸酶的作用受水分影響的機理，以期為稻田土壤砷污染的準確監測和保護修復提供依據.
2 材料與方法
2.1 供試土壤
供試土壤為采自江蘇省中國科學(xué)院常熟農業(yè)生態(tài)試驗站的水稻土(底潛鐵聚水耕人為土，Endogleyic Fe-accumuli-Stagnic Anthrosols).采樣時(shí)，先去除0~5 cm表層土，采用五點(diǎn)法取5~20 cm土樣，混勻風(fēng)干，過(guò)1 mm尼龍篩備用.常規方法測定土壤基本化學(xué)性質(zhì)(鮑士旦，1997)，結果為有機質(zhì)47.69 g·kg-1，pH=6.93(水土比2.5:1)，全氮3.1 g·kg-1，全磷0.61 g·kg-1，全鉀18.02 g·kg-1，堿解氮10.66 mg·kg-1，速效磷11.74 mg·kg-1，速效鉀112.90 mg·kg-1，陽(yáng)離子交換量26.20 cmol·kg-1，游離氧化鐵2.43 g·kg-1，總砷8.70 mg·kg-1，有效砷(0.5 mol·L-1 NaHCO3)0.32 mg·kg-1.
2.2 試驗方案
向600 g土樣中添加不同濃度的As(Ⅴ)(Na3AsO4·12H2O，AR)溶液，使As(Ⅴ)含量分別為0、25、50、100、200、400 mg·kg-1，并調節土壤含水量為最大持水量(WHC)的35%、65%、110%，分別代表土壤水分條件為干燥、濕潤及淹水.混勻后加蓋密閉，于(25±1)℃的培養箱中暗培養，期間稱(chēng)重法控制土壤水分含量;定期(1、8、15、30 d)取樣測定并計算酶動(dòng)力學(xué)參數.
土壤堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)測定：在3.00 g土壤中加入0.25 mL甲苯，15 min后添加20 mL采用緩沖液(pH=9.4)配制的不同濃度(0.0010、0.0025、0.0050、0.010 mol·L-1)的磷酸苯二鈉溶液，37 ℃培養，定時(shí)取樣，采用磷酸苯二鈉比色法測定土壤磷酸酶活性(關(guān)松蔭，1987).每個(gè)處理重復3次，并設無(wú)底物和無(wú)土壤處理為對照.
2.3 數據處理
土壤酶動(dòng)力學(xué)參數Km、Vmax的計算參考文獻，具體而言，米氏常數Km和最大反應速度Vmax可用Michaelis方程的積分式計算：
經(jīng)數學(xué)變換和整理得到：
式中，t為酶促反應時(shí)間(h)，S0、St分別是初始時(shí)刻和t時(shí)刻底物濃度(mmol·L-1).可見(jiàn)，上式是一條1/t×ln(S0/St)對1/t×(S0-St)的直線(xiàn)方程.在反應期間通過(guò)測定不同時(shí)間段利用的底物濃度(或生成的產(chǎn)物濃度)，并通過(guò)線(xiàn)性回歸，即可求得Km和Vmax值.
土壤酶促反應速度常數k計算如下(和文祥等，2001)：
式中，t為酶促反應時(shí)間(h)，S0、St分別是初始時(shí)刻和t時(shí)刻底物濃度(mmol·L-1).
砷對土壤酶抑制常數Ki的計算見(jiàn)文獻(朱銘莪，2011;譚向平，2014)，其中，競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程為：
式中，Ki為抑制常數(mmol·L-1);Km*為抑制劑存在下表觀(guān)米氏常數(mmol·L-1);C為外源砷劑量(mg·kg-1).
線(xiàn)性混合抑制動(dòng)力學(xué)方程為：
式中，Vmax* 為抑制劑存在時(shí)酶表觀(guān)最大速率(μg·g-1·h-1);KS*為酶-底物表觀(guān)解離常數(mmol·L-1).對于線(xiàn)性混合型抑制，V*max=Vmax/β，Ks*=(α/β)Ks;其中：
式中，I為抑制劑濃度(mg·kg-1)，δKi為酶-底物-抑制劑解離常數(mmol·L-1)，δ可表示酶-抑制劑對底物的親和力.
采用Microsoft Excel 2013和SPSS19.0軟件對數據進(jìn)行方差分析及模型擬合，LSD法對各處理間差異進(jìn)行多重比較.
3 結果與分析
3.1 砷對堿性磷酸酶酶促反應動(dòng)力學(xué)特征影響
3.1.1 米氏常數Km的變化
米氏常數Km表征酶與底物結合牢固程度，在數值上等于初速度達到最大反應速度1/2時(shí)的底物濃度.Km值越小，表明酶與底物結合越牢固，親合力越大(和文祥等，1997).從表 1可以看出：①不同水分下堿性磷酸酶Km總體呈現35%WHC>65%WHC>110%WHC的變化規律，3個(gè)水分下Km均值分別為6.08、4.78、3.66 mmol·L-1，表明隨水分含量增加，土壤堿性磷酸酶與底物的親和力增強，酶與底物更易結合.②除個(gè)別處理外，其余處理土壤堿性磷酸酶Km隨砷含量增加而顯著(zhù)增大，表明砷污染導致堿性磷酸酶與底物親和力減弱.③不同處理下Km值雖有差異，但處于同一數量級，整個(gè)試驗處理中Km變幅為2.34~10.95 mmol·L-1.④不同培養時(shí)間的Km變化較小，如砷含量為100 mg·kg-1時(shí)，35%WHC、65%WHC、110%WHC下Km變化范圍分別為5.12~6.44、4.23~5.54、2.35~4.41 mmol·L-1，表明培養時(shí)間對土壤酶與底物親和力影響較弱.⑤相關(guān)分析顯示，35%WHC、65%WHC下砷含量與Km呈顯著(zhù)相關(guān)(r>0.913*)，而110%WHC下則相關(guān)性較差，表明干燥條件下砷顯著(zhù)降低土壤酶與底物的親和力.
表 1 供試土壤堿性磷酸酶米氏常數
3.1.2 酶促反應最大反應速率Vmax的變化
最大反應速率(Vmax)可表征酶-底物復合物分解為酶和產(chǎn)物的能力及土壤中酶的總量，在數值上等于酶完全被底物飽和時(shí)的催化反應速度(和文祥等，2010).從表 2看出：①Vmax隨水分含量增加顯著(zhù)降低，如第30 d，對照處理65%WHC、110%WHC的Vmax較35%WHC下分別降低了35.32%、40.94%，而當砷含量達200 mg·kg-1時(shí)，降幅分別達到42.66%、52.86%.②除個(gè)別處理外，隨外源砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax間變化較小，最大變幅為26%，且處理間差異不顯著(zhù)，表明干燥和濕潤條件下砷對土壤酶-底物復合物的解離影響較弱;110%WHC下Vmax則顯著(zhù)降低，揭示出淹水下砷污染阻礙了堿性磷酸酶-底物復合物解離.③110%WHC下，隨砷含量增加Vmax降幅增大，可能是由于水分飽和條件下As(Ⅴ)向 As(Ⅲ)轉化的緣故(曾希柏等，2010).④35%WHC、65%WHC下，Vmax隨培養時(shí)間延長(cháng)而增加，如砷含量為100 mg·kg-1時(shí)，兩個(gè)水分下第30 d的Vmax值分別為第1 d的1.32、1.15倍，表明酶-底物復合物的分解速率加快，砷的毒性減弱.⑤利用Y=A/(1+B×C)模型(Speir et al.，1999)擬合Vmax與砷含量(C)的關(guān)系.結果(表 3)發(fā)現，僅110%WHC下二者呈顯著(zhù)負相關(guān)關(guān)系(r>0.912*)，表明淹水下Vmax可在一定程度上監測土壤砷的污染程度，且機理為完全抑制作用.⑥生態(tài)劑量值(Ecological Dose)ED10是指酶活性變化10%時(shí)外界污染物的濃度，可表征土壤輕度污染時(shí)的臨界濃度(Doelman et al.，1989).計算獲得水稻土砷污染ED10值為73.52~156.67 mg·kg-1.
表 2 供試土壤堿性磷酸酶最大反應速率Vmax
表 3 堿性磷酸酶最大反應速率Vmax與砷含量(C)的擬合關(guān)系
3.1.3 Vmax/Km及反應速度常數k的變化
在較大范圍內，Vmax/Km是衡量酶促反應初速度的重要指標，可作為土壤質(zhì)量的指標之一.反應速度常數k是酶總體催化能力的指標，從本質(zhì)上反映酶促反應是“快”還是“慢”，且其值與底物濃度無(wú)關(guān)(和文祥等，2009).從表 4可知：①Vmax/Km、k隨水分含量增加總體呈降低趨勢，35%WHC下的Vmax/Km、k顯著(zhù)大于65%WHC、110%WHC下，表明較低水分含量有利于土壤酶催化反應的進(jìn)行.②3種水分下，Vmax/Km、k均隨砷含量的增加而顯著(zhù)降低，表明砷污染本質(zhì)上降低了酶促反應初速度.③35%WHC、65%WHC下，Vmax/Km、k隨培養時(shí)間延長(cháng)而增加，這與Vmax變化規律一致.④利用模型Y=A/(1+B×C)擬合二者關(guān)系，結果(表 5)表明，Vmax/Km、k在一定程度上可作為土壤砷污染程度的監測指標，且砷對土壤堿性磷酸酶的作用機理為完全抑制(包括競爭性抑制和非競爭性抑制)作用(Speir et al.，1999).⑤計算獲得Vmax/Km、k的ED10范圍分別為20.45~70.87 mg·kg-1和66.00~131.89 mg·kg-1.⑥綜合Vmax的結果可看出，Vmax/Km獲得的ED10較小，且不同水分下均呈現出較好相關(guān)性，表明Vmax/Km對砷污染最為敏感，且其比Vmax可更全面、準確地表征不同水分下土壤砷污染程度.⑦根據劑量最小最敏感原則獲得水稻土砷輕度污染的臨界值為20.45 mg·kg-1，此值與國家土壤質(zhì)量標準中的二級污染標準值(25 mg·kg-1)較為接近，從側面表明動(dòng)力學(xué)參數Vmax/Km可較好評價(jià)土壤砷污染程度.
表 4 供試土壤堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數Vmax/Km及反應速度常數k
表 5 堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數Vmax/Km、k與砷含量(C)的擬合關(guān)系
3.2 砷對堿性磷酸酶抑制動(dòng)力學(xué)特征影響
抑制劑對土壤酶抑制類(lèi)型一般包括競爭性、非競爭性、反競爭性及線(xiàn)性混合抑制等(朱銘莪，2011).由表 1、2可知，隨砷含量增加，35%WHC、65%WHC下Vmax變化較小，Km則顯著(zhù)增大，顯示此水分下砷酸根離子會(huì )與底物競爭堿性磷酸酶同一活性中心，抑制類(lèi)型屬于典型競爭性抑制;而110%WHC下，隨砷含量增加，Vmax降低，Km總體增大，表明淹水時(shí)二者作用為線(xiàn)性混合抑制類(lèi)型(包括競爭性抑制和非競爭性抑制)(朱銘莪，2011).
為進(jìn)一步了解砷對磷酸酶的抑制特征，計算了不同條件下砷對土壤酶抑制常數Ki.Ki反映了抑制劑與酶形成復合物的親和力，其值越小，說(shuō)明抑制劑與土壤酶結合形成中間復合物的親和力越強(和文祥等，2010).從表 6結果可以看出：①采用競爭性抑制模型(35%WHC、65%WHC)和線(xiàn)性混合抑制模型(110%WHC)擬合均達顯著(zhù)或極顯著(zhù)水平，揭示出不同水分含量下砷對堿性磷酸酶作用機理差異.②除第30 d外，其余處理110%WHC下Ki均小于35%WHC、65%WHC下，表明淹水增強了砷與土壤堿性磷酸酶的親和力.③35%WHC下Ki隨培養時(shí)間變化規律不明顯，65%WHC、110%WHC下Ki在培養后期(30 d)顯著(zhù)大于前期(1~15 d)，表明隨時(shí)間延長(cháng)，砷與堿性磷酸酶的親和力減弱，對酶的抑制作用減輕，這與Vmax、Vmax/Km、k等隨時(shí)間變化所反映的規律一致.④比較Ki與Km可發(fā)現，除65%WHC、110%WHC下第30 d外，其余處理Ki與Km相差不大;培養第30 d，65%WHC、110%WHC下Ki明顯大于Km，揭示出隨時(shí)間延長(cháng)，酶與底物親和力強于酶與砷親和力.⑤110%WHC下，線(xiàn)性混合抑制模型求得的δ>1，表明酶-抑制劑對底物的親和力比酶對底物的親和力低，進(jìn)一步揭示出線(xiàn)性混合抑制中非競爭性抑制為主要抑制方式(朱銘莪，2011;譚向平，2014).
表 6 砷對供試土壤堿性磷酸酶抑制常數Ki影響
4 討論
不同水分及砷污染處理下Km值雖有差異，但處于同一數量級，這與土壤堿性磷酸酶主要來(lái)源于土壤微生物有關(guān)(Frankenberger et al.，1983;Dick et al.，1984).不同水分下Km隨砷含量增加而增大，表明砷污染減弱了堿性磷酸酶和底物的親和力，這可能是因為砷酸根與磷酸根結構相似，二者共同競爭磷酸酶活性中心(朱銘莪，2011;王紫泉等，2013).35%WHC、65%WHC下Vmax隨砷含量增大變化不明顯，而110%WHC下則顯著(zhù)降低，表明110%WHC下，砷不僅通過(guò)與底物競爭堿性磷酸酶活性中心減緩了中間復合物的形成(Km增大)，也減弱了酶-底物復合物的解離能力(Vmax減小).這可能是因為水分飽和下，砷與酶活性或非活性中心結合，引起酶分子的構象改變，致使活性中心的催化作用降低(朱銘莪，2011);同時(shí)，在水分飽和與砷的雙重脅迫下，土壤微生物活性受到抑制而使分泌的酶減少.
Km隨水分含量增加顯著(zhù)降低，這可能是因為水分含量升高土壤更加分散，被土壤有機質(zhì)或有機質(zhì)-粘粒復合物吸附包裹的酶更多的解離暴露出來(lái)，增加了酶與底物的接觸機會(huì )(雋英華等，2008).Marx等(2005)研究認為，營(yíng)養物質(zhì)(底物)在土壤異質(zhì)體系中的擴散能力會(huì )影響土壤酶動(dòng)力學(xué)參數.在土壤含水量較高情況下，水分可利用性好，底物的擴散能力較強，增加了酶與底物接觸的機會(huì )，故Km減小(Zhang et al.，2009a).另外，供試土壤為水稻土，土壤中有機質(zhì)、粘粒、鐵錳氧化物等含量較大，水分含量較高情況下外源砷進(jìn)入后砷酸根離子會(huì )迅速與土壤發(fā)生吸附、絡(luò )合和沉淀反應等，可能會(huì )置換出部分原來(lái)被土壤粘粒吸附的堿性磷酸酶分子，使其從吸附態(tài)轉變成游離態(tài)，從而使 Km 值變小(楊春璐等，2007).Vmax也隨水分含量升高顯著(zhù)降低，這是由于水分含量增加，酶與底物親和力增強(Km減小)，酶-底物復合物結合的更牢固，減弱了其分解為酶和產(chǎn)物的能力，從而降低形成產(chǎn)物的數量(朱銘莪，2011).另外，淹水條件下，土壤孔隙中氧氣濃度降低，好氧微生物活性受到抑制，土壤酶分泌總量減少，也導致Vmax降低.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
隨水分含量增加，土壤堿性磷酸酶動(dòng)力學(xué)參數Km、Vmax、Vmax/Km、k均減小，土壤酶活性總體降低(謝偉等，2015)，表明土壤表觀(guān)酶活性大小由動(dòng)力學(xué)參數綜合決定，反映在不同條件下，土壤酶的動(dòng)力學(xué)參數發(fā)揮作用有所差異，并最終通過(guò)影響酶動(dòng)力學(xué)參數間接改變不同水分下的土壤酶活性，揭示出不同水分條件下砷抑制堿性磷酸酶活性機理上的差異.如砷含量為400 mg·kg-1，培養第30 d時(shí)，盡管110%WHC下堿性磷酸酶Km最小(4.01 mmol·L-1)，Vmax/Km(44.60×10-3 h-1)也較大，但由于該水分下Vmax(160.33 μg·g-1·h-1)及k(13.00×10-3 h-1)均較小，導致堿性磷酸酶活性顯著(zhù)低于35%WHC、65%WHC下;而35%WHC下，雖然Km最大(9.65 mmol·L-1)，酶與底物親和力最小，但因Vmax(400.26 μg·g-1·h-1)、Vmax/Km(57.97×10-3 h-1)、k(30.39×10-3 h-1)也最大，故該水分下堿性磷酸酶活性最高.可見(jiàn)，土壤酶動(dòng)力學(xué)參數可從不同側面、不同程度地反映土壤酶活性與酶促反應速度，在一定條件下，某一動(dòng)力學(xué)因子起主導作用，從而決定表觀(guān)酶活性的高低.
5 結論
1)隨砷濃度增加，Km增大，Vmax(110%WHC)、Vmax/Km、k減小，表明砷污染不僅減弱了酶-底物的親和力，且減弱了酶-底物復合物的分解能力，減弱了酶促反應初速度，從本質(zhì)上抑制了酶促反應的進(jìn)行.
2)Km、Vmax、Vmax/Km、k、Ki隨水分含量增加而減小，表明水分含量升高雖增加了酶-底物親和力，但也增強了砷與酶的親和力，從本質(zhì)上減弱了酶促反應速度，減緩了酶促反應的發(fā)生.
3)Y=A/(1+B×C)模型較好擬合了動(dòng)力學(xué)參數Vmax/Km(Y)與土壤砷含量(C)之間的關(guān)系，表明Vmax/Km在一定程度上可表征不同水分下土壤砷污染程度，并以此計算獲得水稻土砷輕度污染臨界值為20.45 mg·kg-1，此值與國家土壤標準中的二級污染標準值較為接近.
4)水分條件影響砷對堿性磷酸酶抑制機理，干燥(35%WHC)及濕潤(65%WHC)條件下為完全競爭性抑制作用;淹水(110%WHC)條件下為以完全非競爭性抑制為主的線(xiàn)性混合型抑制作用.各個(gè)酶動(dòng)力學(xué)參數共同反映不同水分條件下砷對土壤堿性磷酸酶抑制機理上的差異.
