1 引言
水體沉積物為許多底棲生物提供棲息場(chǎng)所，是水生生態(tài)系統的重要組成部分.研究表明，沉積物中污染物濃度通常是水溶液中的數百倍甚至數十萬(wàn)倍.在適當的條件下，沉積物中的污染物會(huì )再次釋放到水體中，形成二次污染.重金屬作為沉積物中的一類(lèi)主要污染物，具有毒性大、難降解、易被生物富集等特性，能經(jīng)過(guò)食物鏈傳遞最后影響生態(tài)系統和人體健康.沉積物中重金屬的毒性不僅取決于重金屬的總量，更與沉積物中的賦存形態(tài)有關(guān).Toro和Allen等認為水體沉積物中重金屬的重要結合相是酸可揮發(fā)性硫化物(AVS)、顆粒有機碳和鐵與錳的羥氧化物.在厭氧和缺氧的沉積環(huán)境中，AVS是控制沉積物重金屬生物有效性的關(guān)鍵形態(tài)，也決定了沉積物重金屬的毒性大小.
目前關(guān)于水相中重金屬對水生生物毒性效應的研究較多，而有關(guān)淡水沉積物中重金屬毒性與生物有效性的研究較少.國內有以大型蚤為受試生物，通過(guò)測定其體內的金屬硫蛋白和超氧化物歧化酶來(lái)研究重金屬Cd和Zn的聯(lián)合作用(張融等，2008);范文宏等也以大型蚤研究了水體-沉積物共存體系中Cd的毒性(范文宏等，2009).而趙艷民等以泥鰍死亡率、血液紅細胞數量等指標考察了沉積物中Cd的毒性效應.
本研究以淡水單孔水絲蚓和伸展搖蚊幼蟲(chóng)作為受試生物，它們都是典型的底棲生物物種，被廣泛應用在生物毒性實(shí)驗中(付榮恕等，2008; 曾毅等，2012).搖蚊幼蟲(chóng)還是美國環(huán)�？偩�(EPA)推薦的生物毒性測試物種.通過(guò)對沉積物進(jìn)行Cu、Cd、Ni、Pb、Zn等5種重金屬染毒，分析沉積物中重金屬對水絲蚓和搖蚊幼蟲(chóng)的毒性效應，探討沉積物中酸可揮發(fā)性硫化物(AVS)、同時(shí)可提取金屬(SEM)與毒性效應之間的關(guān)系.研究結果有助于了解沉積物重金屬對底棲生物的毒害效應，為建立基于生物毒性的沉積物質(zhì)量基準提供有效數據.
2 材料與方法
2.1 沉積物的準備
歐洲環(huán)境毒理化學(xué)學(xué)會(huì )認為生物暴露試驗是評價(jià)沉積物中重金屬毒性的唯一可靠途徑(趙艷民等，2011).由于難以獲得大量重金屬本底值較低的天然沉積物，本研究按照Pasteris等推薦的方法(Pasteris et al., 2003)，采用潔凈土壤模擬沉積物進(jìn)行加標染毒.從天津市郊區農田采集潔凈土壤，經(jīng)自然風(fēng)干后，過(guò)40目篩以去除粗顆粒，將所得土壤按1 ∶ 1的體積比與經(jīng)曝氣去氯的自來(lái)水混合并攪拌均勻，所得泥漿靜置一周，獲得與自然沉積物狀態(tài)相似的混合物質(zhì)，加標染毒前棄去上覆水.
所用土壤的重金屬濃度值(測定結果見(jiàn)表 1)與國家標準進(jìn)行比較，Cr、Ni、Cu、Zn、Hg、Pb的背景值達到我國土壤環(huán)境質(zhì)量標準(GB 15618—1995)的一級標準，基本為自然背景水平，而Cd和As的濃度值高于一級標準，低于二級標準，基本不會(huì )對生物造成毒害作用.
表 1 實(shí)驗用土壤中重金屬含量(以干重計)
2.2 沉積物染毒
使用分析純的重金屬鹽試劑，用去離子水配制金屬離子濃度為1000 mg · L-1的標準儲備液.在250 mL的燒杯中放入平衡好的潔凈沉積物(約含干沉積物30 g)，加入一定體積的重金屬儲備液，按1 ∶ 4的體積比在燒杯中加入上覆水進(jìn)行混合，配制成含有不同濃度梯度的染毒沉積物，具體染毒濃度見(jiàn)表 2.用干凈的小木鏟攪拌1 h使混合均勻，然后靜止14 d.期間每隔3 d對加標沉積物充分攪拌1次，對照組沉積物除不加重金屬儲備液外按相同方式進(jìn)行處理.
表 2 沉積物中重金屬的染毒濃度(以干重計)
2.3 生物測試
2.3.1 受試生物
淡水單孔水絲蚓和伸展搖蚊幼蟲(chóng)均在實(shí)驗室長(cháng)期培養馴化.本研究挑選健康受試生物用于毒性實(shí)驗.馴養及生物實(shí)驗用水為經(jīng)48 h 曝氣除氯處理的自來(lái)水，pH 7.80~8.30，DO > 6 mg · L-1，電導率 900~1100 μS · cm-1，水溫(22.4±0.3)℃.
2.3.2 毒性試驗
選擇體長(cháng)3~4 cm左右、環(huán)帶明顯且大小一致的健康成年水絲蚓，將它們放入裝有清水的培養皿中，進(jìn)行24 h清腸.清腸后仍然健康的水絲蚓方可用于正式實(shí)驗.根據美國EPA底棲生物標準實(shí)驗方法(Liber et al., 2011;Mehler et al., 2011; Anderson et al., 2012)進(jìn)行21 d毒性試驗.在每個(gè)燒杯中放入10只水絲蚓，每個(gè)濃度組設置5個(gè)平行.實(shí)驗過(guò)程中輕微曝氣，實(shí)驗溫度為(23±1)℃，光照比16h ∶ 8h，每周進(jìn)行1次喂食.
根據美國EPA底棲生物標準實(shí)驗方法(EPA，2000;OECD，2004)，使用二齡搖蚊幼蟲(chóng)作為受試生物，24 h清腸后進(jìn)行14 d毒性試驗.在每個(gè)燒杯中放入10只搖蚊幼蟲(chóng)，每個(gè)濃度設置5個(gè)平行.實(shí)驗條件基本同水絲蚓，每隔3 d喂食1次.及時(shí)觀(guān)察記錄受試生物的活動(dòng)情況、中毒癥狀和死亡情況等，用針刺激受試生物個(gè)體，無(wú)反應的視作死亡.試驗結束過(guò)篩后計算死亡個(gè)體.
2.4 AVS、SEM測定
采用美國EPA推薦的吹氣-吸收-比色方法測定沉積物中的AVS(雷琳，雷志丹，2009;孟妍等，2012).在氮氣保護的環(huán)境中，稱(chēng)取3~5 g濕沉積物放于反應瓶中，與1 mol · L-1鹽酸溶液反應40 min.所生成硫化氫氣體隨高純氮氣轉移到吸收液(堿性醋酸鋅-醋酸鈉溶液)中，然后用亞甲基藍比色法測定其中的硫化物含量.
將提取完AVS剩下的泥水混合物離心，取上清液;往剩余沉積物中加入1 mL鹽酸(1 ∶ 1)清洗，離心，再取上清液;用蒸餾水清洗兩遍后離心;將離心所得溶液混合并過(guò)0.45 μm膜，然后用ICP-MS測定其中重金屬含量，即為SEM.將離心后的沉積物放入烘箱中烘干，稱(chēng)重，即為樣品干重.
2.5 數據處理
試驗中所有數據均采用Excel 2007進(jìn)行處理，對平均數做Pearson相關(guān)性分析，運用Origin 8.5作圖.平行樣中SEM的相對標準偏差均在10%以?xún)?
3 結果與討論
3.1 沉積物中重金屬對水絲蚓的21 d毒性效應
在實(shí)驗過(guò)程中，上覆水pH值在6.98~7.87之間，DO值在3.4~4.9 mg · L-1之間.對照組的平均存活率為100%，其結果符合沉積物底棲生物實(shí)驗標準.分別以水絲蚓的死亡率和自斷率為毒性終點(diǎn)，實(shí)驗結束后過(guò)篩計算死亡個(gè)數，失蹤的個(gè)體按死亡計數.自斷率為發(fā)生爛尾、尾部斷裂的個(gè)體之和.
水絲蚓對5種重金屬的毒性反應類(lèi)似，當沉積物中重金屬濃度較高時(shí)，水絲蚓出現急劇身體扭動(dòng)且不鉆入沉積物中.隨著(zhù)暴露時(shí)間的延長(cháng)，水絲蚓身體彎曲抱團，對外界的刺激反應逐漸變得遲緩，最終失去逃避能力，身體由紅變白，產(chǎn)生自斷或糜爛直至死亡.當重金屬濃度降低時(shí)，水絲蚓的身體扭動(dòng)反應減弱并有不同程度的延后，部分或全部水絲蚓鉆入沉積物中.
沉積物中重金屬(以干重計)對水絲蚓21 d毒性效應結果如圖 1所示.5種重金屬中Cd對水絲蚓的毒性效應最強.水絲蚓放入高濃度沉積物后立即開(kāi)始劇烈扭動(dòng)，在濃度25 mg · kg-1出現自斷現象，在50 mg · kg-1出現個(gè)體死亡;而在濃度400 mg · kg-1的沉積物中死亡率達70%，自斷率達88%.水絲蚓的死亡率和自斷率均隨Cd濃度增加而增大，與濃度均呈顯著(zhù)正相關(guān)(p<0.01).沉積物中Cu和Ni也會(huì )使水絲蚓產(chǎn)生身體自斷和個(gè)體死亡，但其毒性效應略低于Cd.水絲蚓對沉積物中Pb和Zn的中毒癥狀較輕，沒(méi)有發(fā)現身體自斷現象，在較高濃度下會(huì )出現死亡.根據概率單位法計算，水絲蚓21 d半數致死濃度(LC50)和50%身體自斷效應濃度(EC50)結果見(jiàn)表 3.
圖 1 水絲蚓的毒性效應與沉積物中重金屬濃度的關(guān)系
表 3 沉積物中重金屬對水絲蚓21 d LC50和EC50值
根據水絲蚓的21 d LC50值可知，5種金屬對水絲蚓的毒性大小為Cd>Ni>Cu>Pb>Zn.本研究得出沉積物中Cd對水絲蚓21d LC50為281 mg · kg-1.有文獻報道，當沉積物中Cd的濃度高于60 mg · kg-1(8 d暴露實(shí)驗)時(shí)，水絲蚓(Limnodrilus udekemianus)會(huì )出現死亡情況(Deeds，1999).美國USGS給出Ni加標沉積物28 d對水絲蚓(Tubifex tubifex)無(wú)效應濃度為494 mg · kg-1.由于不同種受試生物對同種污染物的耐受能力相差較大，同時(shí)不同實(shí)驗室所采用實(shí)驗條件不同也會(huì )造成毒性數據的差異.總體來(lái)說(shuō)，本研究的毒性結果基本與已有文獻相符.
付榮恕(2008)采用靜水生物測試法，研究了Pb、Cd單一及復合情況下對霍甫水絲蚓的急性毒性.單一Pb和Cd對水絲蚓24h LC50分別為7.096和31.621 mg · L-1，48 h LC50分別為4.731和23.441 mg · L-1.孫新元(2010)測定了水中Cu對顫蚓的毒性效應，其24 h LC50、48h LC50、72h LC50 分別為237.8、212.2、174.3 μg · L-1.由此可見(jiàn)，水體中Cu對水絲蚓的毒性要高于Cd和Pb，這與沉積物中幾種重金屬的毒性順序不同.這說(shuō)明重金屬對生物的毒性與其在環(huán)境中存在的狀態(tài)有很大的關(guān)系.重金屬可以通過(guò)絡(luò )合等作用與沉積物中的組分發(fā)生結合，其結合態(tài)的生物可利用性決定了對生物的毒性.因而需要進(jìn)一步研究討論沉積物中重金屬的生物有效性與底棲生物毒性的關(guān)系.
3.2 沉積物中重金屬對搖蚊幼蟲(chóng)14 d毒性效應
在實(shí)驗過(guò)程中，上覆水pH值在6.98~7.87之間，DO值在3.4~4.9 mg · L-1之間.毒性效應采用死亡率和平均干重的抑制率為指標.生長(cháng)抑制率為14 d毒性試驗后存活幼蟲(chóng)的平均干重與對照組平均干重的差值的百分比.
沉積物中重金屬對搖蚊幼蟲(chóng)14 d毒性效應結果如圖 2所示.與水絲蚓的中毒癥狀相似，當沉積物中重金屬濃度較高時(shí)，搖蚊幼蟲(chóng)會(huì )發(fā)生劇烈的身體扭動(dòng)且不鉆入沉積物中.隨著(zhù)暴露時(shí)間的延長(cháng)，搖蚊幼蟲(chóng)由開(kāi)始的劇烈扭動(dòng)逐漸變得行動(dòng)遲緩，失去逃避能力，最終身體會(huì )變透明甚至死亡.當濃度逐漸降低時(shí)，搖蚊幼蟲(chóng)會(huì )很快鉆入沉積物中，而且在沉積物中的挖洞行為逐漸變得活躍.但是，在一定重金屬濃度時(shí)，搖蚊幼蟲(chóng)的生長(cháng)明顯受到抑制.如圖 2所示，搖蚊幼蟲(chóng)的死亡率隨重金屬的濃度增加而增大，呈現較好的相關(guān)性;而其生長(cháng)抑制率也隨濃度增加而升高.同樣，對于搖蚊幼蟲(chóng)Cd的毒性最強，在20.7 mg · kg-1時(shí)生長(cháng)抑制率達到61%，死亡率達到50%.5種重金屬對搖蚊幼蟲(chóng)14 d LC50和50%平均干重抑制效應濃度(EC50)結果見(jiàn)表 4.
圖 2 伸展搖蚊幼蟲(chóng)的毒性效應與沉積物中重金屬濃度的關(guān)系
表 4 金屬對搖蚊幼蟲(chóng)的毒性結果
由伸展搖蚊幼蟲(chóng)的14 d LC50可知，5種加標金屬沉積物對搖蚊幼蟲(chóng)的毒性順序為Cd > Pb ≈ Cu > Ni > Zn.Depledge和Rainbow(1990)認為，生物體對重金屬的敏感度和毒性作用受其本身對重金屬離子的吸收、累積和排泄的平衡調節決定.而B(niǎo)idwell和Gorrie(2006)的研究表明水體理化性質(zhì)，如溫度、鹽度、溶氧、pH等也會(huì )影響重金屬對生物的毒性效應.Klaas進(jìn)行的淡水沉積物暴露試驗表明Cd在0.6~1030 mg · kg-1時(shí) 搖蚊幼蟲(chóng)的存活率為46%~81%.得出Ni對搖蚊幼蟲(chóng)的最低可觀(guān)察效應濃度(LOEC)為353 mg · kg-1，與本研究觀(guān)察到的致死率濃度基本相符.
除了Zn以外，其它4種重金屬的搖蚊幼蟲(chóng)的LC50值都顯著(zhù)低于水絲蚓，說(shuō)明沉積物中重金屬對搖蚊幼蟲(chóng)的毒性效應要強于水絲蚓，也就是說(shuō)搖蚊幼蟲(chóng)比水絲蚓對沉積物中重金屬更敏感.綜合考慮，搖蚊幼蟲(chóng)更適用于監測沉積物中重金屬污染.
3.3 AVS與SEM之間的關(guān)系及對重金屬生物有效性的影響
沉積物中重金屬的不同存在形態(tài)決定著(zhù)沉積物中重金屬的污染程度，即決定著(zhù)沉積物中重金屬的毒性(曾毅，2012).研究表明，SEM/AVS的比值與沉積物中重金屬毒性有關(guān)，即當二價(jià)金屬離子的含量高于沉積物中S2-時(shí)會(huì )引起毒性作用(Di Toro et al., 1992b).Di Toro和Ankley認為，當SEM/AVS<1或SEM-AVS<0時(shí)，沉積物中重金屬對底棲生物基本不產(chǎn)生毒害效應;SEM/AVS>1或SEM-AVS>0時(shí)，沉積物重金屬對生物具有潛在毒性(Di Toro et al., 1992b; Ankley et al., 1996).本研究中沉積物AVS含量、重金屬SEM含量以及兩種底棲生物的毒性效應見(jiàn)表 5~表 6.
表 5 用于水絲蚓毒性實(shí)驗的沉積物中AVS、SEM測定結果(以μmol · g-1計)
表 6 用于搖蚊幼蟲(chóng)毒性試驗的沉積物中AVS、SEM測定結果(以μmol · g-1計)
如圖 3所示，水絲蚓和搖蚊幼蟲(chóng)的死亡率隨著(zhù)SEM/AVS摩爾比值的增大而逐漸升高.當SEM/AVS值大于1時(shí)，除Cd外，重金屬對水絲蚓和搖蚊幼蟲(chóng)的毒性效應比較明顯，這說(shuō)明AVS確實(shí)是控制沉積物中重金屬毒性效應的關(guān)鍵因素.而Cd加標沉積物的SEM/AVS值雖然小于1，但其生物暴露實(shí)驗表明其加標沉積物具有較強的生物毒性.從圖 3可以看出，除了Cu和Cd以外，Pb、Zn、Ni對水絲蚓和搖蚊幼蟲(chóng)的致死率與SEM/AVS比值之間表現出良好的一致性，進(jìn)一步說(shuō)明用SEM/AVS可以較好的描述沉積物中重金屬的生物可利用性，同時(shí)也說(shuō)明它們對兩種底棲生物具有相似的致毒機制.
不同重金屬與沉積物中S2-結合作用的強弱不同，因此會(huì )表現出不同的生物有效性.Cd的硫化物溶度積(Ksp=3.6×10-29)比其他幾種重金屬硫化物的溶度積都要低，因此Cd的SEM/AVS值非常低(均小于1).然而，Cd仍對水絲蚓和搖蚊幼蟲(chóng)均有較高毒性，說(shuō)明Cd對底棲生物的毒性效應非常強，即使具有生物有效性的Cd濃度很低，仍然可能導致生物中毒.這也可能與底棲生物吞食沉積物的習性有關(guān)，沉積物中的AVS結合態(tài)Cd可以通過(guò)大量的吞食活動(dòng)在其體內產(chǎn)生累積引起毒性.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
圖 3 水絲蚓、搖蚊幼蟲(chóng)的死亡率與沉積物中SEM/AVS的關(guān)系
4 結論
1)5種重金屬加標沉積物對淡水單孔蚓的21 d毒性順序為Cd > Ni > Cu > Pb > Zn;對伸展搖蚊幼蟲(chóng)14 d毒性順序為Cd > Pb > Cu > Ni > Zn.搖蚊幼蟲(chóng)比淡水單孔蚓對沉積物中重金屬更敏感.綜合考慮，搖蚊幼蟲(chóng)更適用于監測淡水沉積物中重金屬污染.
2)當SEM/AVS>1時(shí)，除Cd外其余4種重金屬均對受試生物表現出較為明顯的毒性效應，用SEM/AVS可以較好地反映沉積物中重金屬的生物有效性.
3)目前關(guān)于沉積物中重金屬對底棲生物毒性效應的數據比較少，相關(guān)的理論也不成熟，急需開(kāi)展相關(guān)的研究，為水體污染控制提供理論基礎.
