斑馬魚(yú)魚(yú)群行為變化對水質(zhì)在線(xiàn)預警的影響

　　1 引言

　　生物在線(xiàn)預警是指利用生物體生理、生化或行為對水環(huán)境變化產(chǎn)生的反應信息，對水質(zhì)惡化趨勢的預測和突發(fā)事件的報警(Gerhardt et al., 2006).與其他生物監測儀器相比較，以監測魚(yú)類(lèi)行為變化為基礎的水質(zhì)生物在線(xiàn)預警系統具有更好的穩定性、可靠性、管理方便且運行費用低，是水源地、河流、污水處理廠(chǎng)等監測水質(zhì)變化的最佳選擇(張金松等，2013).

　　環(huán)境中的污染物對幾乎所有的魚(yú)的行為都能夠產(chǎn)生影響，包括運動(dòng)、繁殖、學(xué)習記憶能力、遷移、對掠食者的回避行為、捕食、社交等(Atchison et al., 1987).Ingram 等(2004)通過(guò)虹鱒魚(yú)的呼吸行為變化，如呼吸頻率和深度等，監測某紙漿和造紙廢水的毒性.Kang等(2009)以污染物暴露后青鱂魚(yú)出現急速游動(dòng)、浮頭行動(dòng)等異常行為作為判斷水質(zhì)是否安全的依據.趙曉艷等(2010)則利用非接觸類(lèi)電場(chǎng)感應斑馬魚(yú)的活躍強度、呼吸頻率等可迅速檢測到水體中有機磷農藥和抗生素的突發(fā)暴露.這些預警系統都是以1~2條魚(yú)為監測單元，因在單獨空間內其個(gè)體行為差異較大，使儀器的穩定性能較低.和個(gè)體相比，當魚(yú)處在群體中時(shí)可互相溝通并傳導信息，擁有更大的感知范圍，并且受到污染物刺激后，魚(yú)群會(huì )通過(guò)回避、急速運動(dòng)、集群等一系列行為的改變來(lái)維持體內的穩定應對環(huán)境的變化(Schlenk et al., 2001).Chew等(2009)改變以個(gè)體魚(yú)為觀(guān)察對象的方式，通過(guò)捕捉20條魚(yú)在魚(yú)缸中的分布和活動(dòng)，考察魚(yú)群的活躍水平、軌跡曲線(xiàn)密度、回避行為以及魚(yú)群中的“社交互動(dòng)”等來(lái)評價(jià)魚(yú)類(lèi)對污染刺激的行為反應.Barry(2011)的研究表明，在一定濃度的化學(xué)藥品的刺激下魚(yú)除了有快速游動(dòng)的反應外，魚(yú)群的軌跡分布也發(fā)生明顯的變化，魚(yú)群更傾向于貼壁運動(dòng)，同時(shí)分形維數也在不斷減小.因此，選擇合理的指標，魚(yú)類(lèi)群體行為變化的連續監測，獲得更加全面的信息，可提高水質(zhì)在線(xiàn)監測預警儀器的靈敏和穩定性.

　　本研究改變以個(gè)體魚(yú)為觀(guān)察對象的方式，通過(guò)捕捉5條斑馬魚(yú)在魚(yú)缸中的分布和活動(dòng)，考察魚(yú)群的游動(dòng)速度、高度、平均距離、分散度和不同區域停留時(shí)間等6個(gè)指標，綜合游動(dòng)行為、通訊行為和分布區域的變化，用更加全面的信息反應水質(zhì)突變狀況.實(shí)驗以正常水體中斑馬魚(yú)的群體行為變化為基礎，模擬氯氰菊酯和溴氰菊酯這兩種典型污染物質(zhì)突發(fā)性聯(lián)合脅迫下，斑馬魚(yú)的行為響應來(lái)驗證監測指標選取的合理和有效性.

　　2 實(shí)驗材料和方法

　　2.1 斑馬魚(yú)的培養

　　實(shí)驗采用的斑馬魚(yú)(Zebrafish，Danio rerio)是國際標準化組織(ISO)推薦的標準實(shí)驗生物之一，在環(huán)境毒性評價(jià)的相關(guān)研究中應用廣泛.本實(shí)驗室對斑馬魚(yú)的飼養繁殖采用流水式，養殖用水為脫氯自來(lái)水，水溫為(28±1)℃，溶解氧為(6.5±0.2)mg · L-1，光照周期為10 h：14 h，以豐年蝦為食，每天投食2～3次.實(shí)驗時(shí)挑選魚(yú)齡為6~8個(gè)月，體長(cháng)為(30±2)mm的斑馬魚(yú)，每組實(shí)驗用魚(yú)5條，雌雄比例為3：2，實(shí)驗前24 h不喂食.

　　2.2 實(shí)驗設計

　　2.2.1 斑馬魚(yú)急性毒性實(shí)驗

　　參照國際標準 ISO 7346 1-3《物質(zhì)對淡水魚(yú)(斑馬魚(yú))急性致死毒性的測定》，以1.5 g(魚(yú))· L-1的要求，設置6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設3個(gè)平行，每組放10尾斑馬魚(yú).實(shí)驗開(kāi)始后第0、8、12、24 h觀(guān)察并記錄各容器實(shí)驗魚(yú)的存活情況.用鑷子夾魚(yú)的尾部，如無(wú)反應，即認為魚(yú)已經(jīng)死亡，發(fā)現死魚(yú)后及時(shí)撈出.利用Graphpad Prism 5.0擬合劑量-效應曲線(xiàn)并計算得出24 h半致死濃度(LC50-24h).

　　2.2.2 斑馬魚(yú)魚(yú)群行為變化實(shí)驗

　　采用水質(zhì)毒性在線(xiàn)檢測儀(RTB，深圳水務(wù)(集團)有限公司研制)進(jìn)行斑馬魚(yú)的個(gè)體和群體行為變化的定量監測，如圖 1所示.在一個(gè)尺寸為400 mm×75 mm×300 mm的測試箱前設置一個(gè)CCD攝像頭，利用攝像追蹤系統和圖像分析技術(shù)，通過(guò)識別每條魚(yú)的特征輪廓來(lái)確定斑馬魚(yú)的運動(dòng)方向與位置，并以12~16幀每秒的速度記錄標志點(diǎn)坐標通過(guò)軟件轉換計算出魚(yú)群的運動(dòng)行為參數，包括游動(dòng)行為(速度和高度)、通訊行為(平均距離和分散度)和區域分布情況(各區域停留時(shí)間占總時(shí)間的比例)，各指標定義如表 1所示.

　　圖 1 測量斑馬魚(yú)行為變化的實(shí)驗裝置設計圖

表1 監測指標的解析

　　實(shí)驗用水采用半靜態(tài)式流水實(shí)驗，控制進(jìn)水流速為1 L · h-1，水溫為25 ℃，光照恒定，盡量減少人為、噪音等非水質(zhì)因素的干擾.實(shí)驗共計運行3 h.其中，前1 h為空白實(shí)驗，記錄該組斑馬魚(yú)在正常水質(zhì)狀況下的各監測指標的變化范圍，從第2 h開(kāi)始時(shí)，即第60 min時(shí)加入化學(xué)物質(zhì)，模擬實(shí)際水體突發(fā)性污染事件，記錄斑馬魚(yú)的行為變化.每組實(shí)驗的行為數據由5條魚(yú)的平均數求得，每個(gè)質(zhì)量濃度進(jìn)行3組平行，結果以3組平行實(shí)驗組的平均值顯示.

　　3 結果

　　3.1 急性毒性實(shí)驗

　　氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚(yú)的24 h半致死濃度如表 2所示.結果表明，溴氰菊酯和氯氰菊酯對斑馬魚(yú)的LC50-24h分別為13.75×10-3 mg · L-1和69.61×10-3 mg · L-1，對斑馬魚(yú)的毒性大小為溴氰菊酯>氯氰菊酯.本研究以L(fǎng)C50-24h為1個(gè)毒性單位(1 TU)，在兩種化合物在各自0.25 TU(氯氰菊酯3.75 μg · L-1和溴氰菊酯15 μg · L-1)的聯(lián)合暴露下觀(guān)察斑馬魚(yú)的行為變化規律.

表2 氯氰菊酯和溴氰菊酯對斑馬魚(yú)的24 h急性毒性

　　3.2 斑馬魚(yú)游動(dòng)行為的變化

　　如圖 2所示，第1 h正常水體暴露時(shí)，無(wú)外界刺激的干擾，斑馬魚(yú)的行為強度變化穩定，游動(dòng)速度主要在30~60 mm · s-1之間均勻波動(dòng)，平均速度為46.52 mm · s-1，標準差為9.08 mm · s-1;而高度在50~200 mm之間均勻波動(dòng)，第1 h的平均高度值為124.60 mm，標準差為39.85 mm，如表 3所示.

　　圖 2 突發(fā)污染暴露下斑馬魚(yú)群體游動(dòng)行為的變化

　　接觸到污染物的斑馬魚(yú)興奮異常，速度在30 min內持續增大，變化范圍明顯高于暴露前水平，在60~85 mm · s-1的范圍內波動(dòng)，最大速度高達84.25 mm · s-1.隨后急劇下降，在15 min內降低至暴露前均值的42%左右，速度分布的標準偏差也是暴露前2倍，如表 3.最終速度維持在10~30 mm · s-1的水平并在后續的暴露中都維持在這一范圍內變化.而高度的變化稍微滯后于速度的突變，在暴露12 min后才明顯增高，并在持續的20 min內均值都高于200 mm，隨著(zhù)暴露時(shí)間的增長(cháng)，高度又逐漸恢復，第2 h的均值大小和暴露前相當，但標準偏差較大，即數據波動(dòng)大.

表3 暴露前后斑馬魚(yú)游動(dòng)行為數值分析

　　3.3 斑馬魚(yú)通訊行為的變化

　　受到污染物刺激后的魚(yú)群明顯失去原有的群體性，在剛接觸到污染物的10 min內有明顯的集群現象，平均距離和分散度短暫下降，然后又逐漸增大.魚(yú)群分布在暴露1 h后與暴露前差異顯著(zhù)，平均距離均值從暴露前124 mm增加到178 mm，即增大43.5%，而分散度均值也由暴露前10%增加到22%，增大120%，如表 3所示.在第2 h的暴露中，平均距離和分散度的變化又有緩慢恢復至暴露前水平的趨勢，均值迅速下降，但標準差仍呈增大趨勢，即數據波動(dòng)變大，如圖 3所示.

　　圖 3 突發(fā)污染暴露下斑馬魚(yú)社交行為的變化

　　3.4 斑馬魚(yú)的運動(dòng)區域的分布

　　從圖 4明顯可以看出，正常水體中，斑馬魚(yú)的運動(dòng)軌跡均勻分布在整個(gè)魚(yú)箱中，污染物暴露后，魚(yú)的活動(dòng)范圍明顯減小，有逃離監測箱左下角(進(jìn)水口)在右上角(出口處)游動(dòng)的趨勢.為了更好的研 究魚(yú)的逃避行為，將這一趨勢進(jìn)行量化，把魚(yú)箱等分為五行五列，分別統計每5 min內斑馬魚(yú)在每一區域的停留時(shí)間占總時(shí)間的比率，結果如圖 5所示.暴露前1 h斑馬魚(yú)在各區域內的分布基本穩定，其中在列1和行5區域內停留時(shí)間較多，為27%和25%左右，隨著(zhù)暴露時(shí)間的延長(cháng)，這兩個(gè)區域的停留時(shí)間逐漸縮短，而列5和行1內有明顯的增加趨勢，都增至25%左右.

　　圖 4 斑馬魚(yú)的魚(yú)群運動(dòng)軌跡圖(a. 第30 min，b. 第90 min)

　　圖 5 斑馬魚(yú)暴露前后運動(dòng)區域的分布

　　4 討論

　　正常水體在監測期間水質(zhì)保持一致，因無(wú)外來(lái)刺激的干擾，斑馬魚(yú)魚(yú)群的行為變化穩定，游動(dòng)速度、高度、平均距離和分散度等指標都在均值上下穩定波動(dòng)，運動(dòng)軌跡在檢測箱中均勻分布.由此可知，斑馬魚(yú)的游動(dòng)行為在正常的水質(zhì)狀況下呈現明顯的規律性，可用于水質(zhì)突變條件下斑馬魚(yú)的行為比較，具有一定的可靠性.Gerhardt等(2002)證明在一定的水體環(huán)境下，利用不同頻率信號記錄的生物的游動(dòng)、爬行、行走和呼吸等運動(dòng)行為參數都在一個(gè)穩定范圍內變化.斑馬魚(yú)就被應用于該儀器中，空白暴露時(shí)穩定的行為變化趨勢為后續污染物暴露的反應提供了可靠的參照(趙曉艷等，2010).

　　利用對化學(xué)刺激品敏銳的感覺(jué)器官，斑馬魚(yú)可感知水體突變的狀況，表現出慌亂不安的過(guò)度活躍(Graham et al., 2004).游動(dòng)速度在暴露過(guò)程中變化最為敏感和劇烈，前30 min內持續增大，變化區間由暴露前30~60 mm · s-1變化到60~85 mm · s-1.這種急速運動(dòng)被稱(chēng)為“回避反應”，是魚(yú)對水環(huán)境污染所產(chǎn)生的第一層次行為變化，其表現形式和所維持的時(shí)間長(cháng)短受暴露化合物的種類(lèi)及濃度的影響(任宗明等，2008).斑馬魚(yú)通過(guò)行為機制逐漸適應污染環(huán)境而導致的行為的變化，但隨著(zhù)暴露時(shí)間的增長(cháng)，污染物逐漸在斑馬魚(yú)體內積累，毒性最終爆發(fā).暴露30 min后，斑馬魚(yú)的游動(dòng)速度急劇下降.有研究表明，溴氰菊酯具有很強的神經(jīng)毒性，可通過(guò)抑制腦突觸體膜上的ATP酶，使突觸后膜上的乙酰膽堿酯酶(AchE)等神經(jīng)遞質(zhì)大量聚集，從而引起腦AchE被抑制，而氯氰菊酯的暴露則可使魚(yú)體內產(chǎn)生大量的氧元素O2-，以致SOD酶活性被抑制，導致鰓、肝等組織的損傷(Soderlund et al., 2002).污染物對斑馬魚(yú)生理及組織等的影響導致其游泳速度最終維持在10~30 mm · s-1之間，僅是暴露前的1/2倍.

　　速度突然增大是魚(yú)類(lèi)對環(huán)境變化刺激的第一反應，其次才是咳嗽頻率等呼吸行為的改變(Gerhardt et al., 2005).Kang等(2009)以“急速運動(dòng)”和“浮頭行動(dòng)”作為衡量青鱂魚(yú)運動(dòng)異常的重要指標，指出污染物質(zhì)對魚(yú)呼吸系統阻礙可導致游動(dòng)深度的變化.但是，對呼吸系統的損傷要有一個(gè)毒物累積的過(guò)程，所以高度的反應會(huì )滯后于速度的變化.從魚(yú)群高度的變化可知，暴露12 min后游動(dòng)高度明顯的增大，由暴露前的50~200 mm變化到150~270 mm.隨著(zhù)暴露時(shí)間的延長(cháng)，斑馬魚(yú)不斷通過(guò)自身的生理和行為調節適應了外界環(huán)境的壓力，游動(dòng)高度在第2 h內逐漸恢復至暴露前水平，但標準差仍然繼續增大，即斑馬魚(yú)不斷調節適應的過(guò)程中行為的穩定性變差.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　受到環(huán)境污染的刺激，魚(yú)類(lèi)會(huì )在驚恐慌亂或靜止某個(gè)角落的狀態(tài)下使魚(yú)群失去原有的分布和通訊行為.接觸到污染物的前10 min內平均距離和分散度迅速下降，魚(yú)群出現短暫的集群現象.黃東龍等(2001)實(shí)證在鉛、鎘等重金屬的暴露下，斑馬魚(yú)在短時(shí)間內發(fā)生明顯的群聚性行為.這種行為也是一種對外界壓力的回避行為.隨著(zhù)接觸時(shí)間的增長(cháng)，魚(yú)群變得松散，群體性游動(dòng)現象減弱，平均距離和分散度的波動(dòng)區間明顯高于暴露前水平，分散度甚至為暴露前的2倍.Chew等(2009)證明在氯的刺激下，斑馬魚(yú)魚(yú)群失去原有的運動(dòng)、分布和社交規律.進(jìn)一步研究中還要再增加一些如平衡損失率、不規則轉彎等個(gè)體異常的監測指標，這樣個(gè)體和群體變化相結合，以獲得更加全面的信息.

　　隨著(zhù)暴露時(shí)間的增長(cháng)，斑馬魚(yú)不斷通過(guò)行為、代謝調節等適應環(huán)境的變化，游動(dòng)高度、平均距離和分散度等逐漸恢復至暴露前水平，但仍選擇在濃度相對較低、接近水面的出水口附近游動(dòng).感知到水體中污染物的存在后，魚(yú)會(huì )往無(wú)污染或污染程度較輕的區域逃避(Clingerman et al., 2007).Gullick等(2003)使裝置形成不同的污染物濃度梯度，結果發(fā)現魚(yú)的大部分時(shí)間集中在潔凈水一端.雖然水箱中的水力流態(tài)是自下向上但進(jìn)水口處的濃度還是高于出水處，魚(yú)可感知這些區域的差異，逃離濃度較高的列1和2的區域在行1和行2的停留時(shí)間明顯增加.

　　5 結論

　　斑馬魚(yú)是一種群游魚(yú)類(lèi)，在水體中連續不斷的游動(dòng)且可互相溝通，和個(gè)體相比集群之后能快速獲得更大的感知范圍，快速傳導信息，為水質(zhì)在線(xiàn)預警提供更加全面、有效的信息.在溴氰菊酯和氯氰菊酯的聯(lián)合暴露的刺激下，斑馬魚(yú)的表現出快速不安的急速游動(dòng)，速度由暴露前30~60 mm · s-1增至60~85 mm · s-1，而高度的變化滯后于速度12 min左右.在活動(dòng)強度發(fā)生改變的同時(shí)，斑馬魚(yú)魚(yú)群的分散度和平均距離也不斷增大，分別增大43.6%和120.0%.但隨著(zhù)暴露時(shí)間的增長(cháng)，污染物也不斷在體內積累，最終導致游泳速度明顯下降且在污染濃度較低的區域停留時(shí)間增長(cháng)，而高度、平均距離和分散度逐漸恢復至暴露前水平，但波動(dòng)較大.利用速度、高度、平均距離、分散度、不同區域停留時(shí)間等6項可完整的描述這一過(guò)程的變化，全面及時(shí)的獲得魚(yú)群受污染物影響的行為變化特征，是用于水質(zhì)預警的可靠指標.后續的研究應該考察斑馬魚(yú)魚(yú)群對其他污染物的行為反應，并通過(guò)計算和比較各指標權重和參與運算的方式，確定一個(gè)能夠綜合評價(jià)水質(zhì)變化程度的參數.