架橋細菌與活性污泥的共凝集及成膜能力研究

　　1 引言

　　共凝集是無(wú)親緣關(guān)系的細菌通過(guò)細胞表面分子進(jìn)行特異性識別進(jìn)而凝集在一起的行為，能夠特異性地增強配對微生物進(jìn)入生物膜的機會(huì ).所謂架橋細菌(Bridge bacterium)，即是一類(lèi)具有廣泛共凝集能力的細菌，它能與多種屬的細菌同時(shí)發(fā)生較強程度的共凝集，在多菌種生物膜形成中起到核心或橋梁作用.架橋細菌的發(fā)現與研究最早出現在醫學(xué)領(lǐng)域(富饒等，2005;郭彤等，2004)，隨之在天然水體或污水處理等水環(huán)境領(lǐng)域里也陸續分離得到諸如藤黃微球菌(Micrococcus luteus)(Paster et al., 2001)、約氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterjohnsonii s35)(Malik et al., 2003)和醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobacter cacoaceticusl)(Simes et al., 2008)等為數不多的架橋細菌.

　　生物膜是多種微生物細胞以主動(dòng)附著(zhù)、吸附、凝集等方式固定于載體表面的復雜微生物群落(Sutherland et al., 2001)，這種自然固定化的微生物可在一定程度上通過(guò)基因表達譜的簡(jiǎn)單變化來(lái)適應其它微生物種屬的存在，形成親密的或特殊的關(guān)系，從而衍生出穩定性和適應性更強的微生物群落(Mah et al., 2001;2003).Di Gioia 等(2004)研究發(fā)現，無(wú)降解能力但有共凝集能力的Bacillus sp. VA160與2株具有壬基酚聚氧乙烯醚降解能力的菌株Acinetobacter sp. BCaL1和Stenothrophomonas sp. BCaL2共培養，2種細菌間凝集體的形成促進(jìn)了復雜有機物的降解.國內也有報道發(fā)現，2株成膜力強的細菌與降解菌混合培養明顯增加了生物膜中降解菌的數量(Li et al., 2009;2008).

　　污水處理中常因降解菌的流失或不易定殖而無(wú)法長(cháng)期維持穩定的降解效果，這一問(wèn)題始終困擾著(zhù)生物強化技術(shù)的應用和推廣.本課題組從多種廢水處理系統的生物膜中篩選出一株有廣泛共凝集能力且具有架橋作用的細菌—Bacillus cereus G5(杜青珍等，2010)，初步研究發(fā)現，G5可與6個(gè)屬的15株不同細菌發(fā)生較強程度的共凝集，并明顯促進(jìn)了生物膜量的增加，顯示出G5作為架橋細菌在促進(jìn)降解菌定殖上的應用潛力.基于此，本研究檢測了G5與來(lái)源于同一批活性污泥中的13株土著(zhù)菌和實(shí)驗室已有的3株降解菌混合后的共凝集能力、生物膜形成能力及廢水處理效果的持久性，通過(guò)對架橋細菌能否以生物自固定化機制促進(jìn)降解菌定殖于生物膜的研究，探索生物強化處理中促進(jìn)降解菌定殖的新思路.

　　2 材料與方法

　　2.1 材料

　　活性污泥取自蘇州市婁江污水處理廠(chǎng)曝氣池.3，5-二硝基苯甲酸降解菌Comamonas testosteroni A3(李蒙英等，2007)、苯酚降解菌Pseudomonas P1、甲基對硫磷降解菌Pseudomonas putid DLL-1(劉智等，1999)及架橋細菌Bacillus cereus G5均為蘇州大學(xué)環(huán)境微生物實(shí)驗室保藏.

　　Luria-Bertani(LB)液體培養基：Tryptone 10 g · L-1，Yeast Extract 5 g · L-1，NaCl 10 g · L-1，pH 7.0~7.4.LB固體培養基在此基礎上另外添加1.5%~2.0%瓊脂.10%LB、5%LB則按比例稀釋.

　　2.2 實(shí)驗方法 2.2.1 土著(zhù)菌分離

　　將采集的活性污泥放入無(wú)菌三角瓶中振蕩，用無(wú)菌生理鹽水系列稀釋后涂布于LB、稀釋10倍的LB(10%LB)、稀釋20倍的LB(5%LB)固體培養基平板進(jìn)行分離培養，挑取單菌落，經(jīng)反復純化后的菌株分別于4 ℃和-80 ℃保藏備用.

　　2.2.2 菌懸液制備

　　分別將G5、降解菌及從活性污泥中分離得到的土著(zhù)菌活化后接種于LB液體培養基，30 ℃、180 r · min-1振蕩培養20 h，5000 r · min-1離心5 min收集菌體，以0.1 mol · L-1、pH=7.0的PBS緩沖液洗滌2次后重懸，調菌懸液OD660至1.0左右備用.

　　2.2.3 共凝集率檢測

　　取制備好的2株配對細菌的菌懸液各5 mL，加入到15 mL無(wú)菌離心管，漩渦混均，室溫靜置孵育，分別于2 h和20 h時(shí)在500 r · min-1條件下離心1 min，660 nm下測上清液吸光值OD660(x+y);兩配對細菌的菌懸液各取10 mL，分別靜置孵育，以相同方法測上清液吸光值OD660x和OD660y，計算共凝集率R(Shen et al., 2005)：

　　式中，OD660(x+y)為某一組合中兩配對菌株的菌懸液混合孵育后的吸光值，OD660x和OD660y為兩配對菌株的菌懸液?jiǎn)为毞跤�后的吸光�?

　　2.2.4 成膜能力測定

　　采用結晶紫染色法(Zhu et al., 2003)測定生物膜量.將菌懸液按1%(V/V)接種量分別接種兩配對菌于裝有已滅菌的2 mL LB、10% LB、5%LB的玻璃試管中，30 ℃、180 r · min-1下振蕩培養24 h，輕輕倒去培養液，用去離子水洗去生物膜表面浮游細菌;加入0.1%結晶紫水溶液2 mL，室溫染色30 min，倒出染色液用去離子水輕輕洗滌2次;自然干燥后，加乙醇/丙酮溶液(80 ∶ 20，V/V)2 mL，洗脫吸附于生物膜上的染料，乙醇/丙酮溶液適當稀釋后測570 nm處的吸光值，計算生物膜量.

　　2.2.5 凝集體觀(guān)察

　　采用電子顯微鏡觀(guān)察凝集體中菌體的組成和分布.

　　2.3 序批式生物膜反應器 2.3.1 實(shí)驗裝置與方法

　　裝置由有機玻璃板制成，尺寸為22 cm×14 cm×16 cm(長(cháng)×寬×高)，有效水深14 cm，有效容積5 L.內部填充半軟性纖維復合填料與聚乙烯多孔球形懸浮填料，約占反應器有效容積的30%左右，通過(guò)氣泵及曝氣砂頭進(jìn)行曝氣.不同反應器設置方案如表 1所示.

表1 3，5-DNBA反應器設置

　　2.3.2 工藝運行

　　反應器接種后悶曝24 h，換水2.5 L，之后每12 h換水2.5 L作為一個(gè)周期，繼續掛膜培養2 d.第4 d排空反應器，加入新鮮廢水，反應器設置為：進(jìn)水0.5 h，曝氣22 h，閑置1 h，排水0.5 h，每天換水2.5 L，運行溫度(26±2)℃.定時(shí)取樣測定出水水質(zhì).

　　苯甲酸合成廢水M1成分(mg · L-1)：NH4NO3 400，KH2PO4 100，K2HPO4 30，MgSO4 200，NaCl 30，酵母粉100，葡萄糖 200，3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)100~1000，pH= 7.0.

　　CODCr采用重鉻酸鉀法測定(國家環(huán)�？偩帧端�和廢水監測分析方法》編委會(huì )，2002);TOC采用總有機碳分析儀(島津TOC-4200)檢測;3，5-二硝基苯甲酸含量采用分光光度計法測定(李蒙英，2007);生物膜量采用稱(chēng)重法測定.

　　3 結果與討論

　　3.1 架橋細菌與土著(zhù)菌和降解菌的共凝集

　　從采集的活性污泥中分離得到13株細菌，分別命名為L(cháng)2、L7、L7R、L8、L15、L25、L31、L47、L48、L51、L61、LF3、LH1，連同已有的3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3、苯酚降解菌P1和甲基對硫磷降解菌DLL-1，分別與G5配對，對其共凝集能力進(jìn)行了測定，結果如圖 1所示.由圖 1可知，G5與16株細菌配對組合的共凝集率在2 h時(shí)達到40%~70%，能與56%(9株)的細菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集反應;20 h時(shí)，共凝集率可達55%~80%，同時(shí)能與高達93%(15株)的細菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集反應.值得注意的是，G5與3種降解菌在20 h時(shí)的共凝集率分別可達到77.7%、59.1%和68.3%，表明在廢水處理系統外G5能與土著(zhù)菌和降解菌發(fā)生較強程度的共凝集.

　　圖 1 G5與土著(zhù)菌、降解菌混合培養不同時(shí)段的共凝集率

　　G5與3株降解菌孵育20 h時(shí)的凝集體見(jiàn)圖 2.G5菌體細胞顯著(zhù)大于3株降解菌，從電鏡照片中可清晰觀(guān)測到G5分別與3株配對菌黏聯(lián)在一起，形成共凝集體，同時(shí)G5和降解菌自身也有自凝集現象，表明G5通過(guò)共凝集和自凝集形成了較大的菌團.

　　圖 2 G5與3株降解菌孵育20h時(shí)的凝集體

　　3.2 架橋細菌與土著(zhù)菌和降解菌混合培養時(shí)的成膜能力

　　在營(yíng)養濃度高的LB培養液中，有93%(15/16)的細菌與G5混合培養時(shí)的生物膜形成量(以OD570表征)高于單菌培養的生物膜形成量，其中11株的成膜能力超過(guò)1.5(圖 3a).在營(yíng)養濃度較高的10%LB培養液中，88%(14/16)的細菌與G5混合培養時(shí)的生物膜形成量高于單菌培養的生物膜形成量，僅有8株成膜能力超過(guò)1.0(圖 3b).在營(yíng)養濃度較低的5%LB培養液中，雖然仍舊有高達93%的細菌與G5混合培養時(shí)的生物膜形成量高于單菌培養的生物膜量，但成膜能力普遍很低，平均只有0.6(圖 3c).

　　圖 3 不同培養基中G5與配對菌單獨培養及混合培養24 h時(shí)的生物膜形成量(a.LB，b. 10%LB，c. 5%LB)

　　無(wú)論單獨培養還是混合培養，生物膜量均隨著(zhù)營(yíng)養濃度的降低而減少.同時(shí)，G5與16株細菌中的大多數細菌混合培養時(shí)均增加了生物膜形成量，表現出促進(jìn)生物膜形成的能力.由此可見(jiàn)，G5不僅具有廣泛的共凝集能力，還具有很強的成膜能力.SPSS分析結果顯示，G5與16株細菌的共凝集率與其成膜量呈顯著(zhù)正相關(guān)，相關(guān)系數達0.896(p<0.01).如圖 1、圖 3所示，G5與3，5-二硝基苯甲酸降解菌A3的共凝集率為62.4%，混合培養時(shí)的成膜能力可達2.5;與苯酚降解菌P1的共凝集率為60.0%，成膜能力為1.8.

　　3.3 序批式生物膜反應器(SBBR)運行結果 3.3.1 反應器的啟動(dòng)掛膜

　　由圖 4a可知，反應器啟動(dòng)時(shí)3，5-二硝基苯甲酸(3，5-DNBA)初始濃度為100 mg · L-1.曝氣過(guò)程中活性污泥隨氣體懸浮并很快附著(zhù)到填料上.悶曝24 h后，投加降解菌A3的2號和3號反應器出水中3，5-DNBA含量分別下降至19.1 mg · L-1和10.1 mg · L-1，而未投加降解菌的對照組1號反應器為89.3 mg · L-1，表明投加降解菌的2個(gè)反應器能快速降解3，5-DNBA.第2 d，對照組1號反應器出水中3，5-DNBA含量降至3.6 mg · L-1，說(shuō)明來(lái)自污水處理廠(chǎng)活性污泥中的混合菌群也對3，5-DNBA進(jìn)行了降解.

　　3.3.2 反應器的長(cháng)期運行

　　第4 d排空反應器，以填料上快速形成的生物膜進(jìn)行廢水處理，運行24 h時(shí)，1、2號和3號反應器出水中3，5-DNBA含量分別降至37.6、7.4和7.3 mg · L-1(圖 4a).表明排空污泥后，2號和3號反應器中生物膜對底物具有快速降解能力，明顯高于未投加降解菌A3的1號反應器.

　　圖 4 反應器出水中3，5-二硝基苯甲酸、COD和TOC含量

　　運行至第13 d，提高進(jìn)水中的3，5-DNBA至200 mg · L-1，14 d時(shí)對照組1號反應器與只投加了A3菌的2號反應器出水3，5-DNBA含量由13 d時(shí)的20.2 mg · L-1和20.4 mg · L-1分別升至111.7 mg · L-1和107.1 mg · L-1;保持此負荷運行1周后，兩個(gè)反應器出水3，5-DNBA含量均穩定在110~120 mg · L-1之間，3，5-DNBA平均降解率分別為34.7%和43.0%，與最初2周的去除率相比有較大幅度下降，表明進(jìn)水3，5-DNBA濃度的增加使其受到較大沖擊.而在投加A3和G5的3號反應器，14 d時(shí)出水3，5-DNBA含量?jì)H為3.0 mg · L-1，3，5-DNBA平均降解率為74.1%，說(shuō)明進(jìn)水負荷的加大對反應器的沖擊較小，保持了穩定的生物強化效果.

　　由于3個(gè)反應器中底物均可較快速的降解，運行后期快速提升底物負荷，30 d時(shí)3.5-DNBA含量達1000 mg · L-1.1號與2號反應器出水中3，5-DNBA含量出現小幅增加，但降解率仍呈現交替上升，最終分別為87.9%和88.1%，兩者降解能力相差不大.3號反應器降解率只出現輕微波動(dòng)，經(jīng)過(guò)短暫調整后3，5-DNBA降解率最終達到88.1%，運行過(guò)程中降解率和穩定性總體上高于1號和2號反應器.3個(gè)反應器對COD、TOC的去除效果表現出與3，5-DNBA相似的變化趨勢(圖 4b、4c).

　　從活性污泥中分離獲得的土著(zhù)菌均不能單獨降解3，5-DNBA，反應器運行結果顯示，未添加降解菌的1號反應器也能較好地降解3，5-DNBA，推測污泥中的混合菌群可能通過(guò)共代謝、協(xié)同作用等方式使復雜有機物3，5-DNBA得到了降解.2號反應器24 h內對3，5-DNBA的快速降解則體現了降解菌A3本身良好的生物強化效果.投加混合菌劑的3號反應器保持了較穩定的3，5-DNBA降解能力，一定程度上說(shuō)明G5促進(jìn)了A3在生物膜中的定殖和生長(cháng)，從而能夠長(cháng)期維持良好的降解效果和較強的抗沖擊負荷能力.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　3.3.3 生物膜量

　　圖 5顯示了運行前、中、后期3個(gè)反應器內生物膜量的變化.由圖可知，運行前20 d，1號和2號反應器內生物膜量呈增長(cháng)趨勢，運行后期膜量下降，表明有一定的脫落.投加混合菌種的3號反應器內，運行后期生物膜量仍保持增長(cháng)，其并未因沖刷引起膜量過(guò)多脫落而導致減少.

　　圖 5 反應器運行過(guò)程中生物膜量

　　4 結論

　　1)G5與13株土著(zhù)菌和3株降解菌兩兩配對組合的共凝集率結果顯示，孵育2 h和20 h時(shí)，G5分別能與9株(占總測定菌株的56%)和15株(占總測定菌株的93%)細菌發(fā)生共凝集率大于50%的共凝集，共凝集率可達40%~70%和55%~80%，表現出廣泛的共凝集能力.

　　2)不同營(yíng)養條件下，90%配對菌與G5混合培養的生物膜形成量高于單菌培養，表現出明顯的促進(jìn)生物膜形成的能力.

　　3)同時(shí)投加降解菌A3與架橋細菌G5的序批式反應器表現出快速的生物強化作用和較強的抗沖擊能力，并保持了較高的生物膜量，說(shuō)明在廢水處理系統內，Bacillus cereus G5亦可能通過(guò)其廣泛的共凝集能力促進(jìn)生物膜的形成，并輔助降解菌以自固定化方式定殖于生物膜中.