微生物燃料電池剛果紅同步脫色和產(chǎn)電性能研究
中國污水處理工程網(wǎng) 時(shí)間:2016-7-13 14:17:31
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1 引言
微生物燃料電池(Microbial fuel cell,MFC)能在降解有機污染物的同時(shí)產(chǎn)生電能,是一種新概念的廢水處理方法(Logan et al., 2006a;2009).其原理為:陽(yáng)極微生物厭氧氧化有機物獲取電子,并將電子傳遞給陽(yáng)極,再通過(guò)外電路傳遞給陰極電子受體(如氧氣),同時(shí)伴隨著(zhù)質(zhì)子由陽(yáng)極到陰極的跨膜擴散(Logan et al., 2006b).
陽(yáng)極微生物是影響MFC產(chǎn)電和降解性能的關(guān)鍵因素(Logan et al., 2008).宋天順等(2012)以氨氮模擬廢水為底物,分別以厭氧污泥和河底沉積物接種單室MFC陽(yáng)極,研究發(fā)現,厭氧污泥接種的MFC的最大功率密度比沉積物接種的MFC大46.8%,但氨氮去除率卻低3.8%.王慧勇等(2012)以模擬淀粉廢水為底物,比較了分別接種生活污水和淀粉廢水的MFC的性能,發(fā)現接種生活污水的MFC的最大功率密度比接種淀粉廢水的高141.3%,氨氮去除率高2.7%. Li等(2013)以廚余浸出液為底物,發(fā)現以厭氧污泥為接種源的MFC的最大功率密度比以生活污水為接種源的MFC低1.8%,但VFA去除率高5.5%;PCR-DGGE分析發(fā)現二者的優(yōu)勢菌種存在顯著(zhù)差異.可見(jiàn),在相同的MFC構型和環(huán)境條件下,接種源的微生物多樣性與基質(zhì)的特異性決定了MFC陽(yáng)極微生物種群結構(Logan et al., 2006b;Pham et al., 2009),從而可能影響了MFC的產(chǎn)電和降解性能(Aelterman et al., 2006).
理論上,在易降解有機物-難降解有機物共基質(zhì)體系中可馴化出能適應難降解有機物的菌種,基質(zhì)的選擇性壓力(Logan et al., 2006b)會(huì )改變MFC陽(yáng)極最初的微生物群落結構,富集出適應于代謝基質(zhì)的優(yōu)勢菌群(Logan,2009; Yang et al., 2012).因此,在課題組前期研究的基礎上(Sun et al., 2009a;2009b;Cao et al., 2010;Hou et al., 2011;Sun et al., 2011;2012),為明確接種源對MFC同步降解剛果紅和產(chǎn)電的影響規律,本研究以葡萄糖-剛果紅為共基質(zhì),以印染廢水和生活污水處理系統中的污泥為接種源,探究?jì)煞N接種源MFC同步降解剛果紅和產(chǎn)電性能情況;并通過(guò)分析陽(yáng)極生物膜電化學(xué)特性,分離并鑒定穩定運行下的MFC陽(yáng)極優(yōu)勢菌種,闡明兩種接種源MFC陽(yáng)極優(yōu)勢菌種差異與降解剛果紅和產(chǎn)電性能之間的關(guān)系,為基于接種源調控的MFC降解難降解有機物和產(chǎn)電提供借鑒.
2 材料與方法
2.1 試劑
剛果紅(C32H22N6O6S2Na2,分析純),購于天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng),使用前未經(jīng)純化處理.
2.2 反應器及其接種與運行
采用好氧生物陰極雙室MFC反應器(Hou et al., 2012),取廣州市獵德污水處理廠(chǎng)和新洲工業(yè)園某印染廢水處理站的厭氧污泥各10 mL,混合后分別作為MFC-M和MFC-I(M、I分別為Municipal、Industrial的縮寫(xiě))陽(yáng)極的接種源,接種濃度為2.0 g · L-1(以MLSS計).從馴化到穩定運行階段,兩個(gè)反應器陽(yáng)極室培養液的組成均保持一致:剛果紅300 mg · L-1、葡萄糖200 mg · L-1、PBS 50 mmol · L-1、微量元素溶液12.5 mL · L-1、維生素溶液12.5 mL · L-1(Lovley et al., 1988).陰極室培養液中不含剛果紅和葡萄糖,其他成分與陽(yáng)極培養液相同.運行過(guò)程中,陰極室維持60 mL · min-1的曝氣量.采用批式運行,當輸出電壓值低于50 mV時(shí)更換培養液.
2.3 電化學(xué)性能表征
電化學(xué)性能表征包括輸出電壓、庫倫效率、功率密度、陰陽(yáng)極極化曲線(xiàn)、循環(huán)伏安和電化學(xué)阻抗譜.MFC的輸出電壓由數據采集系統(Model 2700,Keithly Instruments,USA)每10 min自動(dòng)采集1次.功率密度和陰陽(yáng)極極化曲線(xiàn)采用變電阻的方法在MFC經(jīng)過(guò)數周期運行穩定后進(jìn)行同步測試,電極電勢測定所用參比電極為飽和甘汞電極(SCE,0.242 V vs. 標準氫電極,上海雷磁).單位面積電流密度、功率密度及庫倫效率的計算公式(Logan et al., 2006a)如下:

式中,I為單位面積電流密度(mA · cm-2),U為外電路電壓(V),R為電阻(Ω),A為電極面積(cm2),P為單位面積功率密度(mW · m-2),F為法拉第常數(C · mol-1),VAn為陽(yáng)極室液體體積(cm3),tb為周期時(shí)間(s),ΔCOD為周期初與周期末的COD變化值(mg · L-1),CE為庫倫效率.
循環(huán)伏安(CV)和電化學(xué)阻抗譜(EIS)的測定均在Princeton 2273型電化學(xué)工作站上進(jìn)行.當MFC開(kāi)路電壓達到穩定時(shí),采用三電極體系進(jìn)行測試,其中,工作電極為陽(yáng)極,對電極為陰極,參比電極為飽和甘汞電極.循環(huán)伏安設置測試參數:掃描范圍為-0.7~1.2 V,掃描速率為10 mV · s-1.電化學(xué)阻抗譜設置測試參數:頻率范圍為100 kHz~5 mHz,交流電壓振幅為10 mV.
2.4 剛果紅脫色性能表征
剛果紅(初始濃度300 mg · L-1)脫色率由紫外可見(jiàn)光分光光度計(DR5000,HACH,USA)在其最大波長(cháng)(496 nm)下測定吸光度的減少值計算得到.在48 h內每隔6 h從MFC陽(yáng)極中取樣,稀釋后測定吸光度.脫色率η可由下式計算得到:

式中,A為初始吸光度,B為測試樣品吸光度.
脫色速率可由脫色率-時(shí)間曲線(xiàn)推算得出,由于脫色率隨時(shí)間增加會(huì )先呈現線(xiàn)性上升,在一定時(shí)間后脫色速率明顯降低、脫色率趨于穩定,為簡(jiǎn)化計算,平均脫色速率將直接采用近似線(xiàn)性部分的斜率進(jìn)行計算,具體公式為

式中,S為脫色速率(mg · L-1 · h-1),C0為剛果紅初始濃度(mg · L-1),t為線(xiàn)性部分終點(diǎn)時(shí)間,η為該時(shí)間點(diǎn)對應的脫色率.
采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS,6890 N/5973 inert,Agilent Technologies,USA)對MFC周期末的陽(yáng)極室降解液進(jìn)行產(chǎn)物分析.樣品處理及分析條件參考文獻(廖梅東等,2010).
2.5 優(yōu)勢菌種的分離、純化與鑒定
采用營(yíng)養瓊脂培養基(Nutrient agar,NA)(pH=7.0)作為純菌分離、純化的基礎培養基.在厭氧培養箱中,從穩定運行6個(gè)月以上的MFC-I和MFC-M的陽(yáng)極生物膜上刮下少許,用無(wú)菌去離子水稀釋到10-6倍后涂布平板,在(30±1)℃下的NA培養基中培養48 h.用新鮮的無(wú)菌NA培養基進(jìn)行重復轉移和純化,直到獲得純培養菌株.采用LB(Luria-Bertani)培養基(pH=7.0)作為富集純培養菌株的基礎培養基.所用培養基均通過(guò)多次抽真空和通氮氣以確保去除其中的氧氣.菌種委托寶生物工程(大連)有限公司采用16S rRNA基因序列進(jìn)行鑒定,使用BigDye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit在A(yíng)BI-PRISMTM 3730XL DNA測序儀上進(jìn)行分析,在NCBI上的BLAST-n進(jìn)行比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)分析核苷酸序列.
3 結果與討論
3.1 兩種接種源MFC的啟動(dòng)特點(diǎn)
在外接1000 Ω電阻的條件下,兩種接種源接種的MFC的輸出電壓隨時(shí)間的變化如圖 1所示.在接種后約800 h內(啟動(dòng)階段),MFC-I和MFC-M的輸出電壓均表現出波動(dòng)上升趨勢,但MFC-I的輸出電壓略高于MFC-M.進(jìn)入穩定運行階段后,MFC-I和MFC-M的輸出電壓差別不大.
導致兩種接種源MFC啟動(dòng)初期電壓差別的原因在于剛果紅對微生物的選擇性壓力.印染廢水污泥中微生物長(cháng)期經(jīng)染料馴化,對剛果紅的適應性強,來(lái)自剛果紅的選擇性壓力較小;而生活污水污泥中的微生物首次接觸剛果紅,對剛果紅的適應性較差,來(lái)自剛果紅的選擇性壓力較大.但經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的馴化后,生活污水污泥中的微生物對剛果紅的適應性增強,剛果紅的選擇性壓力減弱,從而使兩種接種源MFC穩定運行時(shí)的輸出電壓相當.
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圖 1 兩種接種源MFC輸出電壓-時(shí)間曲線(xiàn) |
3.2 兩種接種源MFC的產(chǎn)電性能
特定外電阻下的輸出電壓-時(shí)間曲線(xiàn)并不足以從整體描述MFC的產(chǎn)電性能.為探究不同外電阻下MFC-I和MFC-M產(chǎn)電性能的差異,采用變電阻法測試了兩個(gè)反應器的功率密度和極化曲線(xiàn).如圖 2a所示,穩定運行階段MFC-M的最大功率密度達到29.09 mW · m-2,比MFC-I高出2.11倍.陰、陽(yáng)極極化曲線(xiàn)測定結果表明,二者功率密度差異是由陽(yáng)極導致(圖 2b).MFC-I陽(yáng)極開(kāi)路電勢較MFC-M的高,且隨著(zhù)電流密度從0增加到0.015 mA · cm-2,MFC-I陽(yáng)極電勢較MFC-M的抬升幅度更高,表明在相同電流密度下,以印染廢水污泥接種的MFC-I對剛果紅-葡萄糖共基質(zhì)的生物電化學(xué)氧化需要更大的驅動(dòng)力(即能量需求更大),陽(yáng)極過(guò)電勢越大,這與功率密度測定的結果一致.選擇運行1400 h后的3個(gè)穩定周期進(jìn)行庫倫效率的測定與計算,結果表明,MFC-M的庫倫效率(即電子的回收率)較高,達31.89%;而MFC-I的庫倫效率較低,為29.03%.
圖 2 穩定運行階段MFC-I和MFC-M的功率密度(a)與陰、陽(yáng)極極化曲線(xiàn)(b)
生活污水污泥接種的MFC-M產(chǎn)電性能更好,主要原因在于生活污水成分復雜,其污泥中微生物多樣性豐富,包含的產(chǎn)電菌較多(Logan,2009;Yang et al., 2012);而印染廢水污泥在染料的長(cháng)期馴化下微生物種群相對單一,染料降解菌較多.此外,剛果紅的降解與產(chǎn)電是電子競爭過(guò)程,相對于陽(yáng)極,剛果紅優(yōu)先獲得電子(Sun et al., 2012),MFC-I中較多的染料降解菌能競爭到更多的電子用于染料脫色,導致傳遞給陽(yáng)極的電子減少,陽(yáng)極極化明顯.
3.3 兩種接種源MFC陽(yáng)極剛果紅的降解速率和降解產(chǎn)物分析
穩定運行階段,MFC-I和MFC-M對剛果紅的脫色率隨時(shí)間變化如圖 3所示.在運行周期初的12 h內,MFC-I(16.24 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(13.50 mg · L-1 · h-1)高20.3%;12 h后脫色速率均明顯降低,MFC-I(4.69 mg · L-1 · h-1)的平均脫色速率比MFC-M(4.10 mg · L-1 · h-1)高14.4%;在48 h內,MFC-I在任一時(shí)間點(diǎn)對剛果紅的脫色率均比MFC-M高出4%~20%.這是由于印染廢水污泥在染料的長(cháng)期馴化下微生物多樣性相對單一,其功能傾向于優(yōu)先降解染料;結合產(chǎn)電性能比較,可從側面驗證了因剛果紅降解與產(chǎn)電爭奪電子導致的產(chǎn)電性能差異.48 h后,MFC-M和MFC-I對剛果紅的脫色率均達到90%以上,說(shuō)明在剛果紅的長(cháng)期馴化后,兩種接種源對反應器的最終脫色率差異不大.
圖 3 穩定運行階段兩種接種源MFC對剛果紅的脫色率-時(shí)間曲線(xiàn)
兩種接種源MFC陽(yáng)極的剛果紅脫色產(chǎn)物分析如圖 4和圖 5所示.從色譜峰的出峰時(shí)間和峰強度來(lái)看,MFC-I和MFC-M中剛果紅脫色產(chǎn)物相同且濃度相當,主要有3種物質(zhì):2-氨基-1,4-萘醌(15.394 min)、2,2′-二氨基聯(lián)苯(16.345 min)、4,4′-二氨基聯(lián)苯(也稱(chēng)為聯(lián)苯胺,17.861 min),這與孫健等的研究結果一致(Sun et al., 2012).這說(shuō)明在剛果紅-葡萄糖共基質(zhì)環(huán)境下長(cháng)期運行,兩種接種源MFC對剛果紅的降解產(chǎn)物和降解效率差異很小.
圖 4 穩定運行階段周期末MFC-I(a)和MFC-M(b)陽(yáng)極脫色產(chǎn)物氣相色譜圖
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圖 5 穩定運行階段周期末MFC-I和MFC-M陽(yáng)極脫色產(chǎn)物質(zhì)譜圖(a.2-氨基-1,4-萘醌,b.2,2′-二氨基聯(lián)苯,c.聯(lián)苯胺) |
3.4 生物膜電化學(xué)特性
CV被廣泛用于研究MFC中細菌與電極表面的電化學(xué)交互作用機制(Rabaey et al., 2004;2005;Marsili et al., 2008).為了探究長(cháng)期運行下,兩種接種源MFC陽(yáng)極生物膜與電極表面之間的電化學(xué)反應特性差異,對穩定運行階段最大輸出電壓時(shí)和周期末(電壓低于10 mV,基質(zhì)幾乎消耗完全)的MFC陽(yáng)極進(jìn)行了CV掃描.
如圖 6a所示,最大輸出電壓下,MFC-I和MFC-M陽(yáng)極的CV中均呈現出一對明顯的氧化還原峰,分別為-0.41 V的氧化峰和0.52 V的還原峰(MFC-M),以及為-0.31 V的氧化峰和0.66 V的還原峰(MFC-I),但MFC-I氧化還原峰的位置均比MFC-M有些許偏移.這說(shuō)明二者陽(yáng)極表面發(fā)生氧化還原化學(xué)反應的物質(zhì)不同,可能是兩種接種源生物膜中微生物種群的差異所致(Marsili et al., 2008).同時(shí),由圖 6a可看出,MFC-M的氧化還原峰面積及峰高均明顯大于MFC-I,說(shuō)明MFC-M生物膜具有更高的電化學(xué)活性(Carmona-Martinez et al., 2011).由圖 6b可以看出,與最大電壓下(圖 6a)的CV圖相比,周期末CV圖的氧化還原峰的峰高明顯減小,這是共基質(zhì)耗盡的結果.此外,氧化還原特征峰發(fā)生了不同程度的偏移,參考Rabaey等(2004)的研究,推測是剛果紅脫色產(chǎn)物在陽(yáng)極表面進(jìn)一步氧化降解所致.
圖 6 穩定運行階段最大電壓時(shí)(a)和周期末(b)MFC-I和MFC-M陽(yáng)極的循環(huán)伏安曲線(xiàn)
CV和GC-MS檢測發(fā)現,在MFC-M和MFC-I 周期末CV圖中,電壓約為0.747 V時(shí),均出現了峰電流約為16.3 mA的還原峰,其標準還原電位約為-0.201 V;結合GC-MS分析結果推測該峰為生物膜細菌產(chǎn)生的電子氧化還原介體之一的2-氨基—1,4-萘醌的特征峰(Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982).2-氨基—1,4-萘醌的標準氧化還原電位高于細胞脫氫酶NDAH的氧化還原電位值(-0.320 V,Rau et al., 2002),但低于陽(yáng)極電勢(約為-0.100 V)和剛果紅標準氧化還原電勢(+0.102 V),說(shuō)明2-氨基-1,4-萘醌可作為電子介體協(xié)助電子由細胞到陽(yáng)極和剛果紅分子的傳遞.其次,至今發(fā)現的醌類(lèi)電子介體及其標準氧化還原電位已有2-氨基—3-羧基—1,4-萘醌(-0.071 V)、2-羥基—1,4-萘醌(-0.137 V)、1,2-萘醌(+0.135 V)、1,2-萘醌—4-磺酸(+0.217 V)(Yamazaki et al., 1999;Rau et al., 2002;Fultz et al., 1982;dos Santos et al., 2007),產(chǎn)物中擁有萘醌結構的2-氨基—1,4-萘醌的標準氧化還原電位約為-0.201 V,與其他醌類(lèi)電子介體的標準氧化還原電位相近.最后,根據Nortemann等(1994)的研究發(fā)現,醌類(lèi)電子介體是在Pseudomonas sp. BN6降解萘磺酸鹽的過(guò)程中由微生物代謝得到的.剛果紅與萘磺酸鹽同樣有醌類(lèi)基團,且陽(yáng)極優(yōu)勢菌種也以Pseudomonas sp.為主(見(jiàn)3.5節).由此推斷,Pseudomonas sp.在代謝剛果紅的過(guò)程中,使其斷鍵生成2-氨基—1,4-萘醌,而2-氨基—1,4-萘醌作為電子介體可進(jìn)一步促進(jìn)氧化還原反應的進(jìn)行.
采用EIS測定了兩種接種源MFC陽(yáng)極在最大電壓時(shí)的阻抗,其能斯特曲線(xiàn)如圖 7所示,阻抗分析見(jiàn)表 1.圖 7中,曲線(xiàn)高頻部分與X軸的交點(diǎn)對應值為歐姆阻抗Rs,從高頻到低頻得到半圓的擬合直徑為極化阻抗Rct.由表 1可看出,MFC-I和MFC-M陽(yáng)極的Rs和Rd均較小(約3~5 Ω),因此,陽(yáng)極阻抗主要由表征電子傳遞速率的極化阻抗Rct導致.如圖 7和表 1所示,在輸出電壓最大時(shí),MFC-M陽(yáng)極Rct比MFC-I陽(yáng)極低38.0%,說(shuō)明MFC-I的陽(yáng)極電子供應不足或電子傳遞阻力較大,這與測得的陽(yáng)極極化曲線(xiàn)一致.因為MFC-I中染料脫色菌較多,加速了剛果紅脫色,消耗了大量來(lái)自共基質(zhì)葡萄糖的電子,致使傳遞給陽(yáng)極的電子急劇減少.
圖 7 最大電壓時(shí)MFC-I和MFC-M陽(yáng)極的能斯特曲線(xiàn)(Zre為阻抗Z的實(shí)部,Zim為阻抗Z的虛部)
表1 穩定運行階段最大電壓時(shí)MFC-I和MFC-M陽(yáng)極的內阻分析
3.5 兩種接種源的MFC陽(yáng)極優(yōu)勢菌種分析
從MFC-M和MFC-I陽(yáng)極各分離出3株純菌,分別命名為M-P、M-P2、M-B和I-P、I-P2、I-A,繪制系統發(fā)育樹(shù)如圖 8所示.由圖可知,MFC-M的優(yōu)勢菌為Pseudomonas sp.(M-P、M-P2)和Bacillus sp.(M-B);MFC-I的優(yōu)勢菌為Pseudomonas sp.(I-P、I-P2)和Aquamicrobium sp(I-A).其中,I-P和M-P、I-P2和M-P2、I-P和I-P2、M-P和M-P2、I-A和I-P、I-A和M-B、M-B和M-P的同源相似性分別為100%、99%、99%、99%、83%、81%、80%.可見(jiàn),在一定的環(huán)境條件下,接種源微生物多樣性與特征基質(zhì)決定了MFC陽(yáng)極優(yōu)勢菌種.
圖 8 MFC-I和MFC-M陽(yáng)極生物膜上優(yōu)勢菌種的系統發(fā)育樹(shù)
在同步降解剛果紅與產(chǎn)電MFC中的微生物一般可分為兩種:①產(chǎn)電菌,主要負責傳遞電子到電極;②剛果紅降解菌,主要負責降解剛果紅及其脫色產(chǎn)物(Sun et al., 2012).Pseudomonas sp.和Bacillus sp.均為最常見(jiàn)的產(chǎn)電菌屬.其中,Pseudomonas sp.能分泌電子介體(如綠膿菌素),加速電子由細胞表面到陽(yáng)極表面的傳遞,并且這類(lèi)生物型電子介體還可被其他細菌利用,進(jìn)行種間電子傳遞,增大MFC輸出功率(Rabaey et al., 2004,2005;Logan et al., 2009).而B(niǎo)acillus sp.在MFC中主要借助溶解性電子介體傳遞電子(Nimje et al., 2009).同時(shí),Pseudomonas sp.和Bacillus sp.也是常見(jiàn)的染料降解菌(Cervantes et al., 2011;Jain et al., 2012).故可以判斷MFC-M在產(chǎn)電和剛果紅降解方面的高效性能歸功于同為產(chǎn)電菌和染料降解菌的優(yōu)勢菌種Pseudomonas sp.和Bacillus sp..從圖 8中可以看出,在MFC-I中也分離出了與MFC-M中同源性較高的Pseudomonas sp..此外,關(guān)于A(yíng)quamicrobium sp.雖然在MFC領(lǐng)域中的應用雖然鮮有報道,但已發(fā)現其能夠代謝雜環(huán)化合物噻吩-2-甲酸叔丁酯(Bambaue et al., 1998)、聯(lián)苯和聚氯聯(lián)苯(Chang et al., 2013),因此,極有可能具有降解剛果紅的能力.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
綜上分析可以初步判斷,兩種接種源MFC陽(yáng)極均存在產(chǎn)電菌和剛果紅降解菌,但由于各優(yōu)勢菌屬的剛果紅降解與產(chǎn)電途徑和能力的差異,從而導致了二者在同步降解剛果紅與產(chǎn)電過(guò)程中功率密度、剛果紅脫色速率和生物膜電化學(xué)活性的差異.
1)分別以印染廢水污泥和生活污水污泥接種MFC,研究發(fā)現,接種源會(huì )影響MFC的產(chǎn)電性能.啟動(dòng)階段,MFC-I的輸出電壓高于MFC-M;但穩定運行階段,二者最大輸出電壓差別不大.穩定運行階段MFC-M最大功率密度比MFC-I高2.11倍,陽(yáng)極Rct比MFC-I低38.0%,生物膜電化學(xué)活性更強.
2)接種源同時(shí)會(huì )影響MFC對剛果紅的脫色性能,但對剛果紅的降解產(chǎn)物沒(méi)有影響.MFC-I對剛果紅的脫色速率比MFC-M高14.4%~20.3%,主要降解產(chǎn)物均為2-氨基—1,4-萘醌、2,2′-二氨基聯(lián)苯、4,4′-二氨基聯(lián)苯.
3)接種源還會(huì )導致MFC陽(yáng)極優(yōu)勢菌種的差異.二者均存在Pseudomonas sp.,但MFC-M陽(yáng)極還存在優(yōu)勢菌Bacillus sp.,而MFC-I的陽(yáng)極還存在優(yōu)勢菌Aquamicrobium sp.