1 引言
合成染料廣泛應用于印染、制皮、化妝品、印刷、醫藥和食品加工等行業(yè)，然而，這些染料大多數都具有生物毒性和致畸致癌性，而且在自然環(huán)境中極難生物降解，對光、生物酶和其他環(huán)境條件的抵抗力極強.
孔雀石綠作為一種三苯甲烷類(lèi)染料，廣泛應用于水產(chǎn)養殖業(yè)、食品加工業(yè)、醫藥行業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域中.隨其廣泛使用，該染料對哺乳動(dòng)物細胞、水生生物和其他有機生命體的致癌致畸效應也凸現出來(lái)，引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注.因此，在許多國家和地區，該染料已被立法嚴禁使用，且被美國食品和藥物管理局列為致癌性測試的優(yōu)先化學(xué)物質(zhì)之一.然而，由于孔雀石綠的生產(chǎn)成本較低、穩定性強且使用效果較好，難以找到合適的替代物，導致很多地區仍在廣泛使用該染料，嚴重破壞了使用地區的生態(tài)平衡盡管許多科學(xué)工作者已致力于解決由孔雀石綠造成的環(huán)境污染問(wèn)題，例如應用吸附、化學(xué)沉淀、光降解、滲透和膜過(guò)濾等理化處理技術(shù)處理污染水源;然而，由于這些處理方法不僅處理費用高、效率不高，而且在治污的同時(shí)容易產(chǎn)生二次污染和難以處置的底泥，因此，極大地限制了其廣泛推廣使用.生物處理技術(shù)作為一種環(huán)境友好型且高效低耗的處理手段受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注.其中，細菌由于生長(cháng)速度快，容易獲得大量生物量，且易產(chǎn)生大量降解相關(guān)酶，對染料的降解效率也較高等優(yōu)勢而受到環(huán)境工作者的青睞.
本研究的目的在于：①廣泛篩選浙南地區的MG高效脫色菌株;②初步鑒定MG高效脫色菌株為DH-9;③采用單因素實(shí)驗研究菌株DH-9對MG的脫色特性，并采用響應面設計優(yōu)化脫色條件.
2 材料與方法
2.1 實(shí)驗材料 2.1.1 菌種來(lái)源
供試土樣取自浙江溫州雙嶼皮革城和溫州大羅山果園，菌株DH-9來(lái)源于常年被皮革廢水污染的污泥中.
2.1.2 試劑
孔雀石綠屬于三苯甲烷類(lèi)染料，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司;革蘭氏染色液;TE緩沖液;Tris飽和酚(pH 8.0);氯仿;10×PCR緩沖液、DNA 連接酶、dNTPs和Taq DNA 聚合酶(TaKaRa 公司);DNA 純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)等.其它生化試劑均為國產(chǎn)分析純.
2.1.3 培養基
無(wú)機鹽培養基(MSM)組成(g · L-1)：Na2HPO4，15.13;KH2PO4，3.0;NaCl，0.5;NH4Cl，1.0;MgSO4 · 7H2O，0.491;CaCl2 · 2H2O，0.026;pH 7.0.LB培養基組成(g · L-1)：蛋白胨，10;酵母膏，5;NaCl，10;pH 7.0~7.2.純化培養基組成(g · L-1)：在MSM培養基中添加終濃度為200 mg · L-1的MG染料.
2.2 實(shí)驗儀器
超凈工作臺;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱;高壓蒸汽滅菌鍋;全溫恒溫搖床;電子天平;pH計;高速冷凍離心機;Evolution 260紫外可見(jiàn)光分光光度計;Bio-rad PCR儀、自動(dòng)凝膠圖像分析儀及水平電泳儀等.
2.3 實(shí)驗方法 2.3.1 MG高效脫色菌株的富集、分離和純化方法
將1.0 g土樣接入已滅菌的含100 mL MSM培養基的三角瓶中，同時(shí)在MSM培養基中添加已過(guò)濾除菌的MG母液作為唯一碳源，使其終濃度為20 mg · L-1.將三角瓶置于30 ℃、180 r · min-1搖床中振蕩培養1周后，吸取1 mL培養液轉接至新鮮培養基(含40 mg · L-1的染料)中，連續馴化、富集.轉接多次后，培養物可耐受的染料終濃度為200 mg · L-1.用接種環(huán)蘸取少許富集培養液，在純化培養基平板上直接劃線(xiàn)分離.在平板上選擇不同形態(tài)特征的單菌落，重新轉接至含200 mg · L-1 MG的純化培養基平板上，轉接多次直至獲得單一形態(tài)的MG脫色菌純培養物.
2.3.2 菌株16S rRNA基因的PCR擴增與序列分析
(1)提取基因組DNA：采用酚-氯仿法抽提基因組DNA，具體步驟參考《分子克隆實(shí)驗指南》.
(2)16S rRNA基因PCR反應：用于菌株DH-9 16S rRNA基因PCR反應的引物為一對通用引物，正向引物BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′;反向引物BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3，PCR產(chǎn)物的純化和測序由上海生工生物工程有限責任公司完成.所得序列用BLAST程序與GenBank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中的菌株進(jìn)行比對，選取一些具有代表性的菌株用于系統發(fā)生樹(shù)的構建.采用軟件CLUSTAL X 1.8.3進(jìn)行DNA序列同源性比較.比對結果用MEGA 4.1軟件中的Neighbor-Joining的距離模進(jìn)行UPGA分析后生成系統發(fā)育樹(shù).
2.3.3 菌株DH-9對MG的脫色特性研究
(1)培養基起始pH值對MG脫色的影響：用1.0 mol · L-1的HCl或NaOH將2.0 g · L-1酵母粉溶液的初始pH值分別調整到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0.滅菌后添加過(guò)濾除菌的MG，使MG終濃度為100 mg · L-1，接種等量菌株DH-9過(guò)夜培養物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養.
(2)培養溫度對MG脫色的影響：分別設定培養溫度為15、20、25、30、35和40 ℃.在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加過(guò)濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過(guò)夜培養物(2%，V∶V)，并于180 r · min-1條件下振蕩培養.
(3)接種量對MG脫色的影響：在2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加過(guò)濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，分別接種1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%和15%(V：V)的菌株DH-9過(guò)夜培養物，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養.
(4)碳氮源對染料脫色的影響實(shí)驗：將所選碳源(葡萄糖、麥芽糖、乳糖、D-半乳糖、D-果糖、D-木糖和蔗糖)分別添加至MSM培養基中，使其終濃度為2.0 g · L-1.將所選氮源(NH4Cl、NaNO3、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和L-谷氨酸)分別添加至無(wú)NH4Cl的MSM培養基中，使其終濃度為2.0 g · L-1.滅菌后添加過(guò)濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過(guò)夜培養物(2%，V∶V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).
(5)金屬離子對MG脫色的影響：分別向2.0 g · L-1的酵母粉溶液(pH 7.0)中添加終濃度為1.0和2.0 mmol · L-1的CuCl2、FeCl3、CaCl2、ZnCl2、MgCl2和MnCl2，滅菌后添加過(guò)濾除菌的終濃度為100 mg · L-1的MG，接種等量菌株DH-9過(guò)夜培養物(2%，V：V)，并于30 ℃、180 r · min-1條件下振蕩培養(Parshetti et al., 2006; Kalme et al., 2009).
所有實(shí)驗均重復3次以上，并同時(shí)設置對照實(shí)驗.
2.3.4 響應面設計優(yōu)化菌株DH-9對MG的脫色條件
在單因素實(shí)驗的基礎上，采用中心組合試驗設計(Central Composite Design，CCD)對MG脫色條件進(jìn)行優(yōu)化，培養8 h后測定其脫色率.用標準多項式回歸方法，對CCD設計實(shí)驗數據進(jìn)行擬合，得到一個(gè)二次多項式：
式(1)中，Y為預測目標函數;β0為常數;βi為線(xiàn)性系數;βii為平方系數;βij為交互作用系數.本實(shí)驗采用五因素三水平CCD設計來(lái)研究操作參數對MG脫色的影響，具體設計如表 1所示.
2.4 數據統計分析
CCD實(shí)驗設計數據采用Minitab 14.0軟件進(jìn)行統計分析.
3 結果與分析 3.1 MG高效脫色菌株的篩選與鑒定
經(jīng)多次富集、純化培養后，獲得了多株對MG有一定脫色能力的菌株，其中菌株DH-9對MG的脫色效果最好，同時(shí)，全波長(cháng)掃描結果顯示脫色后有新的吸收峰產(chǎn)生(數據未給出)，加之脫色后菌體沉淀呈現無(wú)色，推測該菌株對MG的脫色可能是由生物降解引起的.因此，隨后著(zhù)重對菌株DH-9進(jìn)行了鑒定.
革蘭氏染色結果顯示菌株DH-9是革蘭氏陰性菌，短桿狀.菌落呈現圓形，乳白色，半透明，表面光滑濕潤.
以菌株DH-9基因組為模板，用引物BSF8/20和BSR1541/20進(jìn)行PCR擴增，檢測PCR產(chǎn)物、回收、純化后測序，獲得1475 nt的DH-9菌株的16S rRNA基因片段，在GenBank中的登錄序號為KC736654.該序列經(jīng)與GenBank中的數據比對后發(fā)現，其相似度與Enterobacter aerogenes strain ATCC 13048的相似度達到98%以上，并且在系統進(jìn)化樹(shù)中也與該菌株聚類(lèi)在一起(圖未給出)，表明菌株DH-9屬于腸桿菌屬.
3.2 菌株DH-9對MG的脫色特性 3.2.1 pH值和溫度對MG脫色的影響
培養基初始pH值對MG脫色影響的結果如圖 1a所示.培養12 h時(shí)，pH值在4.0~9.0之間的MG培養基脫色率在90%以上.培養24 h以后，pH值在3.0~9.0之間的MG培養基脫色率均在90%以上，說(shuō)明該菌株對MG脫色的pH適應性較強，實(shí)際應用潛力較大.
圖 1
圖 1 pH(a)和溫度(b)對MG脫色的影響
溫度對MG脫色的影響結果如圖 1b所示.由圖可知，培養12 h時(shí)，溫度為30~40 ℃間的MG脫色率在90%以上.隨著(zhù)脫色時(shí)間的延長(cháng)，當培養時(shí)間超過(guò)24 h后，所測溫度范圍內(15~40 ℃)的MG脫色率均超過(guò)90%，表明該菌株對MG脫色的最適溫度范圍為30~40 ℃，溫度適應性較好.
碳氮源對MG脫色的影響如圖 2a、圖 2b所示.實(shí)驗結果表明，培養48 h以?xún)葧r(shí)，多數所測試碳源對MG脫色有抑制效應或無(wú)顯著(zhù)影響;而當培養時(shí)間超過(guò)72 h后，多數所測試碳源對MG脫色有促進(jìn)作用，其中以乳糖、半乳糖和果糖促進(jìn)效果最為顯著(zhù)，總體而言，所測試碳源中以半乳糖對MG脫色的促進(jìn)效果最好.與碳源相比，多數所測試氮源對MG脫色的促進(jìn)效果優(yōu)于碳源，實(shí)驗中所測試的氮源均能顯著(zhù)促進(jìn)MG脫色.有機氮源(牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、甘氨酸和谷氨酸)比無(wú)機氮源(NH4Cl和NaNO3)的促進(jìn)效果要好，其中尤以酵母粉、谷氨酸和甘氨酸的促進(jìn)效果最好.
圖 2
圖 2 碳(a)、氮(b)源和金屬離子(c)對MG脫色的影響 (1.1.0 mmol · L-1氯化銅; 2.2.0 mmol · L-1氯化銅; 3.1.0 mmol · L-1氯化鐵; 4.2.0 mmo · L-1氯化鐵; 5.1.0 mmol · L-1氯化鈣; 6.2.0 mmol · L-1氯化鈣; 7.1.0 mmol · L-1氯化鋅; 8.2.0 mmol · L-1氯化鋅; 9.1.0 mmol · L-1氯化鎂; 10.2.0 mmol · L-1氯化鎂; 11.1.0 mmol · L-1氯化錳; 12.1.0 mmol · L-1氯化錳) Fig. 2 The effect of carbon(a)，nitrogen(b)resources and metal ions(c)on MG decolorization(1.1.0 mmol · L-1 CuCl2; 2.2.0 mmol · L-1 CuCl2; 3.1.0 mmol · L-1 FeCl3; 4.2.0 mmol · L-1 FeCl3; 5.1.0 mmol · L-1 CaCl2; 6.2.0 mmol · L-1 CaCl2; 7.1.0 mmol · L-1 ZnCl2; 8.2.0 mmol · L-1 ZnCl2; 9.1.0 mmol · L-1 MgCl2; 10.2.0 mmol · L-1 MgCl2; 11.1.0 mmol · L-1 MnCl2; 12.1.0 mmol · L-1MnCl2)
金屬離子對MG脫色的影響如圖 2c所示.由圖可知，大多數所測試金屬離子對MG脫色沒(méi)有顯著(zhù)效應，僅Cu2+和Fe3+對MG脫色有顯著(zhù)抑制效應，鈣離子對脫色有微弱促進(jìn)效應.
3.2.3 接種量對MG脫色的影響
接種量對MG脫色的影響結果如圖 3所示.當接種量從1%上升至3%時(shí)，MG脫色率上升趨勢顯著(zhù);而當接種量繼續增大時(shí)，MG脫色率變化趨勢則趨于平穩，均維持在90%以上.
圖 3
圖 3 接種量對MG脫色的影響
3.3 菌株DH-9對MG的最優(yōu)脫色條件 3.3.1 回歸方程和預測模型的構建
采用CCD設計優(yōu)化MG的脫色條件和研究主效應因子間的交互作用，實(shí)驗結果和模型預測結果如表 1所示.實(shí)驗所得培養8 h后的孔雀石綠的脫色率分布在78.0%~99.2%之間，說(shuō)明主效應因子對MG脫色影響顯著(zhù).MG脫色率的實(shí)驗值和預測值基本保持一致，說(shuō)明所獲得模型精確性較高.所獲得模型的回歸系數和統計學(xué)分析(ANOVA)結果如表 2和表 3所示.結果顯示，模型的決定系數R2和校正決定系數(adjusted R2)分別為99.7%和99.2%，這就說(shuō)明該模型精確性較高，可以用于MG脫色率的預測.因此，適于預測MG脫色率的二次模型公式可表示如下：
式(2)中，DP是MG的脫色率，A到D是CCD設計的5個(gè)自變量，分別為pH、溫度、半乳糖、酵母粉和氯化鈣濃度.回歸分析的F值和p值分別為201.26和<0.001，這說(shuō)明該模型的顯著(zhù)性較高.線(xiàn)性和交互作用選項的p值也<0.001，這說(shuō)明線(xiàn)性選項和交互作用選項AC、AD、AE、BC、BD、BE、CD、CE、DE對MG脫色的影響顯著(zhù).此外，“l(fā)ack of Fit”選項的F值和p值分別為4.57和0.058，說(shuō)明相對于純誤差“l(fā)ack of Fit”不顯著(zhù)，進(jìn)而說(shuō)明該模型與響應值(MG的脫色率)的擬合效果較好.
3.3.2 主效應因子間的相互作用
用Minitab 14.0軟件分析獲得的因素間交互作用的2D圖如圖 4～6所示.圖 4顯示了pH和半乳糖、酵母粉、氯化鈣濃度之間的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響，結果表明pH和這3種因素之間的交互作用顯著(zhù).如圖所示，隨著(zhù)pH值逐漸升高，脫色率隨半乳糖和酵母粉濃度的升高而逐漸降低，但其隨氯化鈣濃度的升高則呈現出先升高再降低的趨勢.
圖 4
圖 4 pH和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響
圖 5顯示了溫度和半乳糖、酵母粉、氯化鈣濃度之間的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響，結果表明溫度和這3種因素之間的交互作用顯著(zhù).由圖可知，隨著(zhù)溫度逐漸升高，脫色率隨半乳糖和酵母粉濃度的升高而逐漸降低，但其隨氯化鈣濃度的升高則呈現出先降低再升高的趨勢.
圖 5
圖 5 溫度和半乳糖(a)、酵母粉(b)、氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響
圖 6顯示了半乳糖濃度和酵母粉、氯化鈣濃度之間以及酵母粉濃度和氯化鈣濃度之間的顯著(zhù)的交互作用及其對脫色的聯(lián)合影響.圖 6a和6b表明隨著(zhù)半乳糖濃度的逐漸升高，脫色率隨酵母粉和氯化鈣濃度的升高而呈現降低趨勢.由圖 6c可知，隨著(zhù)酵母粉濃度的逐漸升高，脫色率隨氯化鈣濃度的升高也呈現降低趨勢.
圖 6
圖 6 半乳糖和酵母粉(a)、氯化鈣(b)及酵母粉和氯化鈣(c)濃度對MG脫色的影響
3.3.3 預測模型的驗證
為了確定CCD實(shí)驗所獲得二次模型的精確性，我們進(jìn)行了驗證實(shí)驗.由軟件分析獲得的最優(yōu)操作參數如下：pH值為6.0，半乳糖、酵母粉和氯化鈣濃度分別為1.0 g · L-1、1.0 g · L-1和3.0 mmol · L-1，培養溫度為34.5 ℃.在此條件下進(jìn)行的驗證實(shí)驗結果表明孔雀石綠的最高脫色率為99.4%，在置信范圍(100%±1%)區間內，因此，該模型對響應值的擬合效應較好.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 討論
孔雀石綠在自然環(huán)境中難以自然降解，且該染料具有致癌致畸性，已引起廣大環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注.以往的研究顯示，很多微生物被從環(huán)境中分離出來(lái)，測試其對孔雀石綠的脫色行為，如Parshetti et al.(2006)研究了靜止兼氧條件下，Kocuria rosea MTCC 1532菌株對MG的脫色，研究結果發(fā)現當MG初始濃度為50 mg · L-1、接種量為10%(V：V)時(shí)，其培養5 h后的脫色率可達到100%，而當MG的初始濃度提高到70 mg · L-1和100 mg · L-1時(shí)，其脫色率分別僅為13%和6%;Daneshvar et al.(2007)應用微藻Chlorella sp.進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗，實(shí)驗結果顯示，該微藻僅在MG濃度為10 mg · L-1以下、接種量為9×106 cells · mL-1時(shí)，培養2.5 h后的脫色效果較好(脫色率可達80.7%);Ayed et al.(2009)也分離出了一株MG脫色菌，經(jīng)其研究發(fā)現，在搖動(dòng)狀態(tài)下、接種量為14×107 cells · mL-1，該菌對50 mg · L-1的MG的4 h脫色率可達75%.已分離的菌株對孔雀石綠的脫色行為各異，但總體而言，脫色效率仍差強人意.與以往這些報道相比較，菌株DH-9在好氧條件下，當接種量為3%(V：V，菌體干重約0.23 g · L-1)時(shí)，對100 mg · L-1 的MG 8 h脫色率可達99.4%，脫色效果較好.
實(shí)際染料廢水處理過(guò)程中，環(huán)境因素很難控制，進(jìn)而導致處理效率不高.以往的研究結果表明，溫度和pH等環(huán)境因子對多數菌株的染料脫色能力影響顯著(zhù)(Khan et al., 2013).例如，Jung et al.(2013)的研究表明Pseudomonas sp. MGO僅在pH 5~7的范圍內對MG有較高的脫色率，而當pH<5和pH>7時(shí)，MG脫色率則不足20%;同樣，Shedbalkar et al.(2011)和Kalyani et al.(2012)的報道中也指出pH和溫度等環(huán)境因子會(huì )顯著(zhù)影響脫色菌株對MG的脫色能力.相比而言，本研究中菌株DH-9在pH3.0~9.0之間及溫度范圍為15~40 ℃時(shí)，培養24 h后，MG 的脫色率均可達到90%以上，說(shuō)明該菌株對pH和溫度的適應性較強，進(jìn)而表明該菌株的實(shí)際應用潛能較為廣闊.
5 結論
1)通過(guò)自然界中的優(yōu)勢菌種強化處理泄漏至水環(huán)境中的有毒害染料是國際上的研究熱點(diǎn)之一.本研究從浙江溫州分離篩選到1株孔雀石綠高效脫色菌株Enterabacter sp. DH-9，其pH(3.0~9.0)和溫度(15~40 ℃)適應性都較強，培養24 h后的脫色率可達90%以上;且多數金屬離子對其脫色都沒(méi)有顯著(zhù)的影響，說(shuō)明其實(shí)際應用潛力較大.
2)通過(guò)響應面設計獲得了該菌株脫色孔雀石綠的最優(yōu)操作條件為：pH 6.0、1.0 g · L-1的半乳糖、1.0 g · L-1的酵母粉、3.0 mmol · L-1的氯化鈣以及培養溫度為34.5 ℃，并構建了適于預測孔雀石綠脫色率的二次模型公式.進(jìn)一步的研究將以該菌株脫色孔雀石綠的機理和其實(shí)際應用為中心，開(kāi)展更加深入的探索.
