溶解氧對活性污泥系統的脫氮效果研究

　　1 引言

　　活性污泥法是最重要的污水處理工藝之一，在世界范圍內已被廣泛地應用于處理市政污水和工業(yè)廢水，其工藝流程通常是將厭氧、缺氧和好氧環(huán)境結合起來(lái)實(shí)現除碳磷和脫氮的功能.活性污泥系統是一個(gè)功能強大的微生態(tài)系統，其中，最主要的自養菌是硝化細菌，即氨氧化細菌(AOB)與亞硝酸鹽氧化菌(NOB).為了實(shí)現持續穩定的硝化效果，污水處理廠(chǎng)通常將曝氣池中的溶解氧(DO)濃度控制在2 mg·L-1以上.但在較低的DO濃度下，完全混合式或者生物膜反應系統中也能實(shí)現完全的硝化作用.如果污水處理廠(chǎng)能在低DO環(huán)境下實(shí)現穩定達標，那么將大大降低污水廠(chǎng)的運行能耗.本研究通過(guò)一個(gè)長(cháng)期運行的缺氧/好氧(A/O)推流式活性污泥小試試驗系統，考察系統的脫氮效果和系統內硝化細菌群落結構隨DO濃度變化的規律，探討低DO生物脫氮的可能性，以期為實(shí)際污水廠(chǎng)在低DO濃度下實(shí)現穩定高效的硝化效果，節約能耗提供可靠的理論依據.

　　2 材料與方法

　　2.1 材料

　　接種污泥取自北京北小河污水處理廠(chǎng);進(jìn)水為人工配水，COD為300~400 mg·L-1，NH4+-N濃度為45~55 mg·L-1，pH控制在7.5~8.5.

　　2.2 反應器裝置和運行條件

　　采用缺氧/好氧(A/O)推流式活性污泥工藝，缺氧和好氧池總體積為37.5 L，缺氧池/好氧池的體積比為1:4，水力停留時(shí)間為9 h;沉淀池體積為24 L，停留時(shí)間為3 h.進(jìn)水流量為96 L·d-1，混合液回流比R=200%，污泥回流比r=150%.實(shí)驗裝置如圖 1所示.

　　圖 1 反應器裝置示意圖(1.進(jìn)水桶，2.進(jìn)水泵，3.A/O反應池，4.攪拌器，5.曝氣頭，6.內回流泵，7.污泥回流泵，8.二沉池)

　　在實(shí)驗過(guò)程中，溫度維持在20~25 ℃，SRT為20 d，反應器初始污泥濃度在3000 mg·L-1左右.以DO為3 mg·L-1啟動(dòng)反應器，待系統穩定后將DO逐漸降低到2、1、0.5、0.3和0.2 mg·L-1運行，在本研究中，3和2 mg·L-1屬于高DO濃度工況，而1、0.5、0.3和0.2 mg·L-1屬于低DOI濃度工況.

　　2.3 水質(zhì)和污泥性質(zhì)測定

　　系統運行期間每隔2~4 d取水樣測定進(jìn)出水水質(zhì)，采用國標法進(jìn)行測定，檢測項目包括COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和TN.在每個(gè)工況的運行后期采集活性污泥樣品，置于-80 ℃保存. MLSS和SVI分別采用馬弗爐燃燒減重法和30 min沉降法測定.

　　2.4 硝化細菌群落結構分析

　　2.4.1 DNA的提取

　　用改進(jìn)的Zhou法提取活性污泥的DNA，即玻璃珠振蕩-SDS-氯仿異戊醇法.

　　2.4.2 硝化細菌的聚合酶鏈式反應(PCR)擴增

　　AOB的擴增：采用其功能基因amoA的引物對amoA-1F(GGGGTTTCTACTGGTGGT)和amoA-2R(CCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC)進(jìn)行PCR擴增，擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性 60 s，51 ℃退火 90 s，72 ℃延伸90 s，共40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸10 min，冷卻至4 ℃保存.

　　NOB的擴增：對于Nitrobacter，選用F1370 F1(CAGACCGACGTGTGCGAAAG)和F2843 R2(TCCACAAGGAACGGAAGGTC)進(jìn)行PCR擴增，擴增程序為：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸 45 s，共35個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸5 min，冷卻至4 ℃保存;對于Nitrospira，選用NSR 1113f(CCTGCTTTCAGTTGCTACCG)和NSR 1264r(GTTTGCAGCGCTTTGTACCG)進(jìn)行PCR擴增，擴增程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán);最后在72 ℃下延伸15 min，冷卻至4 ℃保存.

　　每種引物對的前端引物附40 bp的GC夾，便于后續的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，PCR反應的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

　　2.4.3 DGGE分析

　　將4 μL PCR樣品和1.5 μL 6倍加樣緩沖液混合，采用Bio-rad突變檢測系統，用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度為45%~75%，在110 V的電壓下60 ℃電泳6 h，用SYBR GREEN I染料對凝膠進(jìn)行染色，獲得DGGE指紋圖譜.

　　2.4.4 基因測序

　　用潔凈的手術(shù)刀切取DGGE圖譜中的目的條帶，利用聚丙烯酰胺DNA回收試劑盒(索萊寶科技公司，北京)進(jìn)行回收，回收純化后的DNA用同樣的對應引物對進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物送上海英駿生物公司進(jìn)行測序.序列通過(guò)NCBI基因庫進(jìn)行在線(xiàn)BLAST比對分析.

　　2.4.5 相似性和多樣性分析

　　通過(guò)比較相似性系數(Cs)來(lái)分析樣品圖譜的相似性.試驗所得圖像用BIO-RAD的Quantity One軟件分析.微生物多樣性指數采用Shannon指數(H)表示，公式為：H=-∑PilgPi，其中，Pi=ni/N，ni為峰面積，N為所有峰的總面積.

　　3 結果討論

　　3.1 不同DO條件下A/O系統的脫氮效果和污泥性質(zhì)

　　3.1.1 不同DO條件下A/O系統的脫氮效果

　　圖 2和圖 3分別顯示了在不同DO條件下A/O小試系統內進(jìn)出水的氮素濃度和去除率.硝化過(guò)程是耗氧反應，當小試系統曝氣池中的DO濃度維持在3 mg·L-1和2 mg·L-1時(shí)，系統在很短的時(shí)間內就能實(shí)現很好的硝化效果，當改變曝氣池中的溶解氧濃度，系統在幾天之內氨氮的去除率即可穩定.當把系統曝氣池中的DO調至1 mg·L-1時(shí)，由于突然從高DO狀態(tài)調節至低DO狀態(tài)，運行初始階段出水水質(zhì)存在波動(dòng)，但經(jīng)過(guò)2周左右的培養和馴化后出水氨氮和總氮均達到了穩定狀態(tài)，繼續降低曝氣池中的DO濃度，使其維持在0.5 mg·L-1時(shí)，出水氨氮和總氮并未出現較大的波動(dòng)，氨氮的平均去除率均為98%以上，總氮的平均去除率為85%以上.當進(jìn)一步降低DO至0.3 mg·L-1時(shí)，盡管經(jīng)過(guò)30 d的連續運行，氨氮的平均去除率下降到了95.4%，總氮的平均去除率為83.46%，整個(gè)過(guò)程出水水質(zhì)波動(dòng)較大，難以達到穩定的狀態(tài). 然而，當DO繼續降低到0.2 mg·L-1時(shí)，系統出現了大幅度波動(dòng)，出水氨氮和總氮濃度非常高，連續運行了30 d后，出水水質(zhì)也未達標. 這些水質(zhì)結果表明該系統的運行DO濃度只能降低到0.5 mg·L-1.

　　圖 2 A/O小試系統內進(jìn)出水的氮素濃度

　　圖 3 A/O小試系統內氨氮和總氮的去除率

　　傳統生物脫氮過(guò)程的硝化反應是在好氧條件下進(jìn)行的，氧氣作為電子受體，氮元素作為電子供體，將氨氮氧化為硝酸鹽氮.因此，為了能充分實(shí)現硝化反應，污水處理廠(chǎng)往往將DO設計到2 mg·L-1以上. 根據本研究的結果，在DO為0.5 mg·L-1的情況下，系統也能很好地實(shí)現硝化作用，這樣可以大幅度節約硝化反應所需要的能源.當DO從0.5 mg·L-1繼續降低到0.3 mg·L-1甚至到0.2 mg·L-1，系統曝氣池中的硝化效果受到了較大的制約，這可能是因為在此DO濃度下曝氣池中污泥易于沉降，泥水難以達到充分的混合.為了保證在此濃度下依然能達到較好的脫氮效果，可以在曝氣池中加裝攪拌器通過(guò)攪拌作用使泥水充分混合，但這會(huì )增加能量的消耗.另外，還可以通過(guò)增大污泥停留時(shí)間(SRT)來(lái)補償低DO工況下由于氧氣不足所造成的脫氮效果下降. Liu等的研究結果也證明了這一點(diǎn)，他們考察了SRT為10 d和40 d兩種情況下，當DO降低到0.2 mg·L-1以下時(shí)，在SRT為10 d的系統中硝化效果很難達到穩定，而在SRT為40 d的系統中硝化效果較為穩定.

　　3.1.2 不同DO條件下A/O系統的MLSS和SVI的變化規律

　　隨著(zhù)DO濃度的降低，活性污泥的MLSS和SVI均呈上升趨勢. MLSS增加的幅度不是很大，DO為3、2、1、0.5和0.3 mg·L-1時(shí)，系統達到相對穩定狀態(tài)時(shí)活性污泥的平均MLSS分別為3925、4155、4550、4910和5150 mg·L-1.總的來(lái)說(shuō)，MLSS隨著(zhù)DO的降低而增加，這也與其它文獻報道的研究結果相一致. SVI也是隨著(zhù)DO的降低而升高，系統內的DO為3和2 mg·L-1時(shí)，活性污泥的SVI值在60~100 mL·g-1之間，活性污泥具有很好的沉降性能. DO為1 mg·L-1的工況下，活性污泥的SVI值在100~120 mL·g-1之間，沉降和凝聚性能依然很強.DO為0.5 mg·L-1時(shí)，活性污泥的SVI值在140~160 mL·g-1之間，也屬于較正常的范圍. 但當DO濃度降低到0.3 mg·L-1運行時(shí)，系統中的活性污泥的SVI值在160~180 mL·g-1之間，處于膨脹狀態(tài)，這也很好地證明了DO濃度為0.3 mg·L-1時(shí)，系統出水水質(zhì)很難穩定達標的結果.

　　3.2 硝化細菌群落分析

　　3.2.1 AOB群落結構和多樣性變化

　　5個(gè)不同DO工況下AOB的amoA功能基因DGGE圖譜如圖 4a所示.由圖可以看出，各個(gè)工況下的AOB菌群豐富度相對較單一，共檢測到8條優(yōu)勢條帶，分別標記為1~8. AOB的群落結構隨著(zhù)DO濃度的降低而發(fā)生了變化，在每個(gè)工況下都存在的優(yōu)勢細菌為條帶4和6所代表的細菌. 當DO降低后，DO濃度為3 mg·L-1時(shí)存在的優(yōu)勢條帶7卻消失了，而且在DO濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，出現了新的優(yōu)勢條帶5.

　　圖 4 不同DO條件下AOB的DGGE圖譜(a)和所有條帶的檢測示意圖(b)

　　圖 4b顯示，從高DO變化到低DO，系統內AOB群落結構的動(dòng)態(tài)變化率約為20%~40%，屬于中等程度的變化，高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)環(huán)境中AOB種群多樣性指數(H)較為相似(表 1).在不同的DO環(huán)境下，A/O小試系統中AOB的多樣性均處于較高的水平.DO為3 mg·L-1時(shí)小試A/O系統中AOB的多樣性最高，AOB的種群多樣性隨DO濃度的降低而減小，但減小的幅度很小，DO的降低并未對AOB的群落結構造成太大的影響，系統中各種優(yōu)勢細菌分布的均勻性和穩定性使得系統中AOB群落始終處于很穩定的狀態(tài)，保證了系統氨氧化功能的穩定性.

　　表 1 不同DO條件下各種硝化細菌的多樣性指數(H)

　　圖 4a中標有阿拉伯數字的優(yōu)勢條帶的測序結果顯示(表 2)，AOB均屬于Nitrosomonas，未檢測出有Nitrosospira，其中，條帶1、2、3和4屬于Nitrosomonas-like cluster，條帶 5屬于Nitrosomonas europaea，條帶6和7均為Nitrosomonas oligotropha所屬的細菌.條帶5和7均屬于低DO(0.5 mg·L-1)環(huán)境中的優(yōu)勢AOB，由此說(shuō)明，所屬Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha 的AOB均可在低DO的環(huán)境中生存，特別是Nitrosomonas europaea所屬的AOB非常適合在0.5 mg·L-1的DO濃度下生存.這一結果也與其他研究者的結果相一致(Park et al.，2008; Liu et al.，2013).

　　表 2 DGGE條帶的測序結果

　　3.2.2 NOB群落中Nitrobacter群落結構的變化

　　由圖 5a可知，Nitrobacter的群落結構隨DO的降低發(fā)生了明顯的變化，高DO環(huán)境(3和2 mg·L-1)的Nitrobacter群落與低DO環(huán)境(1、0.5和0.3 mg·L-1)的Nitrobacter群落結構存在較大的差異，DO為1和0.5 mg·L-1工況下Nitrobacter的群落結構最為相似，共同的優(yōu)勢種群為條帶Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7，Nb8則在DO為0.5 mg·L-1的環(huán)境下更為豐富，Nb18是DO為1 mg·L-1工況下存在的優(yōu)勢條帶.當DO繼續降低至0.3 mg·L-1時(shí)，系統中的優(yōu)勢種群轉變?yōu)镹b4、Nb21、Nb22、Nb23，系統中的優(yōu)勢種群數量明顯降低.

　　圖 5 不同DO條件下Nitrobacter的DGGE圖譜(a)和所有條帶的檢測示意圖(b)

　　圖 5b顯示，DO為1和0.5 mg·L-1工況下的Nitrobacter群落結構最為相似，高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)環(huán)境下Nitrobacter的群落結構相似性較低，不同DO環(huán)境中的Nitrobacter群落結構差異較大，但1、0.5和0.3 mg·L-1工況下的Nitrobacter群落結構相似性較高. Shannon-Weiner 指數(H)顯示(表 1)，不同DO環(huán)境下的Nitrobacter群落結構差異較大，但每個(gè)DO工況下的優(yōu)勢種群數量均較高，優(yōu)勢細菌的均勻性也較高，因此，每個(gè)DO工況下的Nitrobacter群落均處于穩定狀態(tài)，保證了系統硝化功能的穩定性.

　　測序結果顯示(表 2)，系統中鑒定出的Nitrobacter可分為3類(lèi)，分別為Group1 Nitrobacter、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter，其中，Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8、Nb9、Nb21、Nb22和Nb23屬于Group1 Nitrobacter，也是數量最多的一類(lèi)Nitrobacter，Nb15、Nb16、Nb17、Nb18、Nb19和Nb20屬于Group2 Nitrobacter，Nb12、Nb13和Nb14屬于Group3 Nitrobacter.因此，結合圖 5b可以進(jìn)一步看出，系統DO從高濃度(3、2 mg·L-1)降低到低濃度(1、0.5和0.3 mg·L-1)時(shí)，系統中的Nitrobacter的種類(lèi)從Group2和Group3轉變成了Group1.另外，從測序結果也可以看出，N. winogradskyi系統中的優(yōu)勢Nitrobacter，但在高低DO工況下，它們屬于不同的發(fā)育分支.

　　3.2.3 NOB群落中Nitrospira群落結構的變化

　　由圖 6a可知，不同DO條件下的Nitrospira群落結構變化較小，系統中的優(yōu)勢細菌始終為Np3和Np4，相比于有著(zhù)豐富群落結構的Nitrobacter，系統中Nitrospira的優(yōu)勢種群較少.

　　圖 6 不同DO條件下Nitrospira的DGGE圖譜(a)和所有條帶的檢測示意圖(b)

　　圖 6b顯示了Nitrospira的DGGE圖譜的條帶分布、強度及每個(gè)工況的DGGE圖譜各樣品間的相似性.總體而言，不同DO條件下小試A/O系統曝氣池中的Nitrospira種群相似性較高，種群結構沒(méi)有發(fā)生較大的改變. 高DO(3和2 mg·L-1)和低DO(1、0.5和0.3 mg·L-1)環(huán)境下Nitrospira的群落結構相似性較高，從高DO變化到低DO，系統內細菌群落結構的動(dòng)態(tài)變化率約為10%~40%，變化程度較小.因此，DO的變化并未對Nitrospira的種群結構和多樣性產(chǎn)生較大的影響，不同DO環(huán)境中的Nitrospira群落結構相類(lèi)似. Shannon-Weiner 指數(H)顯示(表 1)，高DO下的Nitrospira多樣性相對較低，而在0.5 mg·L-1的系統中，兩種Nitrospira均為優(yōu)勢菌，其均勻度較高，因此，相應的多樣性指數較高.

　　測序結果顯示(表 2)，系統中鑒定出的Nitrospira均屬于Group1 Nitrospira，系統中并未檢測出Group2 Nitrospira中的細菌，Np1、Np2、Np3、Np4所代表的細菌均屬于同一類(lèi)細菌，而且同源性很高，由此也說(shuō)明，小試A/O系統中Nitrospira的種類(lèi)較單一，相比于Nitrobacter豐富的種群，Nitrospira的種類(lèi)較少. 這也與類(lèi)似的研究結果相一致.

　　由Nitrobacter和Nitrospira的多樣性指數可以看出，小試A/O系統中最主要的NOB為Nitrobacter.雖然Liu等的研究結果表明，在長(cháng)期的低DO環(huán)境下，Nitrospira-like比Nitrobacter-like的NOB數量更多，但Nitrobacter和Nitrospira具有不同的生存策略，Nitrospira遵循的是K策略，更適應于在低濃度的亞硝酸鹽環(huán)境中生存，Nitrobacter的生長(cháng)實(shí)行的是r策略，在亞硝酸鹽濃度很低的環(huán)境中競爭不過(guò)Nitrospira，但當有足夠的亞硝酸鹽存在時(shí)，Nitrobacter的生長(cháng)速度比Nitrospira更快. 在缺少亞硝酸鹽的環(huán)境中，Nitrospira的含量更豐富，而在本研究的A/O系統中亞硝酸鹽并不是NOB生長(cháng)的限制因子，因此，Nitrobacter是小試A/O系統中最主要的NOB，主要貢獻了亞硝酸鹽的氧化作用.具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　4 結論

　　1)當DO濃度從3 mg·L-1降低到0.5 mg·L-1時(shí)，本研究中的推流式A/O小試系統仍然能保持很好的脫氮效果，氨氮和總氮的去除率分別達到了98%和85%以上;當DO進(jìn)一步降低到0.3和0.2 mg·L-1時(shí)，出水水質(zhì)指標不能達標，系統運行難以達到穩定狀態(tài).

　　2)PCR-DGGE的解析結果表明，A/O小試系統中AOB群落結構的動(dòng)態(tài)變化水平約為20%~40%，Nitrospira群落結構的動(dòng)態(tài)變化水平約為10%~40%，AOB和Nitrospira的群落結構隨DO的變化并不顯著(zhù). 而Nitrobacter的群落結構隨DO的降低發(fā)生了明顯的變化，不同DO環(huán)境中的Nitrobacter群落結構存在較大差異.

　　3)測序結果表明，A/O小試系統活性污泥中的優(yōu)勢AOB主要為Nitrosomonas oligotropha、Nitrosomonas-like和Nitrosomonas europaea，Nitrosomonas oligotropha的AOB更適宜在低DO的環(huán)境中生存. 系統中的Nitrobacter包括Group1 Nitrobacter、Group2 Nitrobacter和Group3 Nitrobacter 3類(lèi)中的細菌，其中，Group1 Nitrobacter是最多的一類(lèi)Nitrobacter，也是適應在低DO環(huán)境下生存的Nitrobacter.小試A/O系統中Nitrospira主要的優(yōu)勢菌種始終是Group 1 Nitrospira.