城市污水管網(wǎng)是一個(gè)收集、 運輸城市污水的系統，是城市水利基建的重要組成部分[1]. 然而，污水在管網(wǎng)內的運輸過(guò)程中水質(zhì)發(fā)生了變化，生化需氧量(BOD)、 化學(xué)需氧量(COD)會(huì )有不同程度的變化[2~6]，溶解性有機碳(DOC)也存在著(zhù)降低的現象[7~9]. 同時(shí)，在污水運輸過(guò)程中，還發(fā)現管網(wǎng)的管壁上有生物膜的形成[10~12]，由此人們開(kāi)始關(guān)注污水管網(wǎng)中微生物對水質(zhì)的改變作用.
在城市污水管網(wǎng)中，由于污水中含有揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等物質(zhì)，為產(chǎn)甲烷過(guò)程提供了物質(zhì)基礎[13~15]. 先前研究發(fā)現，在管網(wǎng)中，確實(shí)有CH4的產(chǎn)生[16~18]. 管網(wǎng)中CH4的產(chǎn)生對管網(wǎng)的運行管理和污水處理帶來(lái)極大的隱患. CH4是一種溫室氣體，管網(wǎng)中的CH4排放到空氣當中會(huì )加劇溫室效應[19, 20]; 當管網(wǎng)內CH4濃度超過(guò)5%時(shí)有爆炸的危險[21, 22]; 管網(wǎng)內CH4的產(chǎn)生會(huì )帶走一部分COD，這不利于后續污水處理廠(chǎng)的生物脫氮除磷的過(guò)程[23, 24]，因此管網(wǎng)中CH4的產(chǎn)生是值得關(guān)注的問(wèn)題. CH4的產(chǎn)生與管網(wǎng)中的產(chǎn)甲烷菌有關(guān)，因此研究管網(wǎng)中的產(chǎn)甲烷菌也具有重要意義. 然而，目前對管網(wǎng)內產(chǎn)甲烷菌的演替規律了解甚少.
基于此，本文通過(guò)建立一套1 200 m管道系統，對污水管網(wǎng)內CH4沿程變化及產(chǎn)甲烷菌的分布特性進(jìn)行研究，并探明了產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)與產(chǎn)甲烷菌分布之間的關(guān)系.
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗條件和原水水質(zhì)
反應器為城市污水模擬管網(wǎng)反應器[25]，以西安市城市污水作為原水，在室溫下運行，實(shí)驗溫度為(25±2)℃，pH為7.2±0.3，密封性良好. 管網(wǎng)沿程的溶解氧(DO)為(0.3±0.05)mg ·L-1，沿程變化不大，總體變化趨勢為沿程降低，且由于管網(wǎng)始端和末端暴露在空氣中，溶解氧相對含量較高，溶解氧沿程變化如圖 1所示.
圖 1 管網(wǎng)沿程中溶解氧的變化
在反應器連續運行期間，通過(guò)控制管網(wǎng)坡度為5‰和污水充滿(mǎn)度0.6，來(lái)使污水流速為0.6m ·s-1，水力停留時(shí)間為1h. 污水依靠重力進(jìn)入模擬管段. 在反應器連續運行期間，原水的水質(zhì)狀況如表 1所示.
表 1 城市污水管網(wǎng)中的水質(zhì)特性
1.2 取樣方法
在800 m的管網(wǎng)系統中選取8個(gè)取樣點(diǎn)，其中選取原水作為0 m處的取樣點(diǎn)，然后一次在分別選取30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m處作為剩余的8個(gè)取樣點(diǎn)進(jìn)行水質(zhì)分析，分析指標包括COD、 氨氮(NH+4-N)、 總氮(TN)、 總磷(TP)等常規指標及發(fā)酵產(chǎn)物. 對于生物分析所需要的生物膜樣品采集，以30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m作為生物膜取樣點(diǎn). 首先將8個(gè)位置的管段兩端的活結松開(kāi)，取下管段，將管段里的有機玻璃條取出，用無(wú)菌棉簽將適量的生物膜從有機玻璃載體上刮入一次性培養皿中并將培養皿蓋好，然后立即放入裝有干冰的保溫盒并送至實(shí)驗室-20℃保存.
1.3 分析方法
1.3.1 乙酸分析
水樣分析之前用3%的磷酸將水樣的pH調節到4左右，再將水樣用0.45 μm濾膜過(guò)濾. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 氫火焰離子化檢測器，色譜柱為DB-FFAP(30 m×0.5 μm×0.32 mm). 升溫程序： 初始柱溫100℃保持2 min，以10℃ ·min-1的速度升至120℃保持2 min，再以6℃ ·min-1升至200℃保持2 min. 進(jìn)樣口溫度200℃，檢測器溫度230℃，進(jìn)樣量1 μL. N2作為載氣和補償氣，速率均為20mL ·min-1. H2速率為35mL ·min-1，空氣為350mL ·min-1.
1.3.2 甲醇分析
測定甲醇和乙醇的濃度選用方法為氣相色譜法，進(jìn)樣方式為頂空進(jìn)樣. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津)，色譜柱為CB-5(30 m×0.5 μm×0.32 mm)，FID檢測器，并配有AOC-5000頂空自動(dòng)進(jìn)樣器. 升溫程序： 50℃保持5 min，以5℃ ·min-1的速度升至100℃，保持2 min，以5℃ ·min-1的升溫速度升至200℃. 進(jìn)樣口溫度為200℃，檢測器溫度為280℃; 載氣流量為5.0mL ·min-1; 分流比2 ∶1. 頂空自動(dòng)進(jìn)樣器條件： 加熱平衡溫度為80℃，加熱平衡時(shí)間30 min; 取樣針溫度為90℃; 進(jìn)樣體積1.0 mL.
1.3.3 甲酸分析
分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長(cháng)設置為210 nm. 流動(dòng)相為0.02mol ·L-1 KH2PO4 ∶甲醇(體積比為95 ∶5)，用磷酸調節pH到2. 流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μL.
1.3.4 甲胺分析
甲胺濃度采用液相色譜法進(jìn)行測定. 上機測樣之前對樣品進(jìn)行PITC衍生化處理，并用C18柱進(jìn)行固相萃取. 分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長(cháng)設置為240 nm. 流動(dòng)相為乙腈 ∶水(體積比為30 ∶70)，流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進(jìn)樣體積10 μL.
1.3.5 CH4分析
CH4的測定選用氣相色譜法，分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 檢測器為熱導檢測器(TCD)，色譜柱型號為T(mén)DX-01填充柱. 柱溫設置為100℃，保持10 min. N2作為尾氣，流速為10.0mL ·min-1. Ar作為載氣，流速為48mL ·min-1. 使用標準氣體混合氣校準，其組分為37% CO2、 4% N2、 0.802% H2以及CH4.
1.3.6 其他水質(zhì)分析
實(shí)驗中COD、 NH+4-N、 TN和TP的測定采用國家標準方法.
1.3.7 DNA提取和PCR擴增
采用Power Soil DNA提取試劑盒(MO Biomedical,U.S.)對生物膜樣本中的DNA進(jìn)行提取，提取方法按照試劑盒制造商提供的方法使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行. 對于產(chǎn)甲烷菌基因片段的擴增，選用特異性引物MLf 5′- GGTGGTGTMGGATTCACACARTA YGCWACAGC-3′和MLr 5′- TTCATTGCRTAGTTW GGRTAGTT- 3′[26]. PCR反應體系(20 μL)： 5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，引物各0.8 μL，FastPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加無(wú)菌水至20 μL. PCR條件： 95℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.
1.3.8 產(chǎn)甲烷菌454高通量測序
用AeyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫，并用2%瓊脂糖電泳檢測. 參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個(gè)樣本的測序要求，進(jìn)行相應比例的混合. 用Roche GS FLX Titanium emPCR試劑盒對混合物進(jìn)行emPCR擴增，擴增后的混合物按照454平臺的標準方法，在Roche 454 GS FLX+Titanium平臺上進(jìn)行上機測序.
2 結果與分析
2.1 管網(wǎng)系統中CH4氣體的產(chǎn)生
圖 2中展現了管網(wǎng)中CH4的含量的變化趨勢，結果表明CH4含量較低均在3%以下，遠小于50%，所以管網(wǎng)內甲烷化程度較低[27]. 從中可以看出，CH4在管網(wǎng)中的變化規律是沿程增加的. 在0~30 m處，沒(méi)有CH4的產(chǎn)生，這可能由于在管網(wǎng)始端，污水中溶解氧含量較高，不適合產(chǎn)甲烷菌富集生長(cháng)，此外污水中的有機物質(zhì)以大分子有機物為主，這些大分子有機物質(zhì)無(wú)法被產(chǎn)甲烷菌直接利用. 隨著(zhù)管網(wǎng)沿程距離的不斷增加，管道內CH4的含量也不斷升高，在1 200 m處達到最大值，其含量為2.75%. CH4含量沿程升高，這是由于管道內的水解發(fā)酵過(guò)程使得大分子物質(zhì)轉化為VFA(乙酸)等小分子物質(zhì)，產(chǎn)甲烷菌得以不斷利用乙酸等可利用基質(zhì)，使得CH4在管網(wǎng)中不斷產(chǎn)生并得到積累，故管網(wǎng)中的CH4含量隨之升高.
圖 2 管網(wǎng)沿程中CH4含量的變化
2.2 管網(wǎng)系統中產(chǎn)甲烷菌的沿程分布特性 2.2.1 管網(wǎng)系統中產(chǎn)甲烷菌的構成及多樣性分布
表 2反映了管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌的構成及其相對豐度情況，從中可以看出，管網(wǎng)中檢測到的產(chǎn)甲烷菌共有9種，其中甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬、 甲烷桿菌科中的菌屬和古菌門(mén)中的菌屬在管網(wǎng)中始終存在.
表 2 管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌的構成1)/%
圖 3展現了管網(wǎng)沿程產(chǎn)甲烷菌的多樣性變化. Shannon指數是表征物種多樣性的指標[28]，因此在圖 3中是通過(guò)Shannon指數來(lái)反映產(chǎn)甲烷菌的多樣性變化. 由于在管網(wǎng)初始端30 m處的生物膜樣本中沒(méi)有生成有效序列，即在30 m處沒(méi)有檢測到產(chǎn)甲烷菌，故30 m處不存在產(chǎn)甲烷菌，這可以很好地解釋圖 2中30 m處沒(méi)有CH4的生成. 從中可以看出，100~600 m之間Shannon指數沿程降低，由100 m處的2.7降低至600 m處的1.58，600~800 m處的Shannon指數保持穩定，說(shuō)明管網(wǎng)800 m之前產(chǎn)甲烷菌的多樣性沿程降低，且在600~800 m之間保持穩定; 在管網(wǎng)1 000 m處，Shannon指數突然升高，此后一直保持穩定，Shannon指數穩定在2.2左右，說(shuō)明管網(wǎng)末端多樣性較為豐富且保持穩定.
圖 3 產(chǎn)甲烷菌多樣性在管網(wǎng)中的沿程變化
2.2.2 管網(wǎng)系統中產(chǎn)甲烷菌菌群結構分析
圖 4所示的是產(chǎn)甲烷菌的熱圖分析，是在屬水平下進(jìn)行的分析，不同的顏色代表了不同的相對豐度值，藍色相對豐度最低，紅色相對豐度最高，圖頂的分支表示了樣本之間的結構相似性. 由于30 m沒(méi)有產(chǎn)甲烷菌，因此管網(wǎng)30 m處的樣本不參與熱圖分析. 圖 4中聚類(lèi)結果表明，管網(wǎng)100~1 200 m中的產(chǎn)甲烷菌群落結構共分為兩大類(lèi)，其中200~800 m為一類(lèi)，100、 1 000和1 200 m為一類(lèi). 200~800 m這一類(lèi)中，600 m和800 m中的群落結構最為相近，而在100、 1 000和1 200 m的這一類(lèi)中，以1 000 m和1 200 m的群落結構最為相似; 在800 m和1 000 m這一相鄰位置處，群落結構發(fā)生了明顯的改變，說(shuō)明在該處存在著(zhù)產(chǎn)甲烷菌的演替現象. 同時(shí)，根據圖中的顏色分布可以看出，在管網(wǎng)中的優(yōu)勢菌群有甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，其中甲烷八疊球菌屬和廣古菌門(mén)中的菌屬為主要優(yōu)勢菌群.
圖 4 產(chǎn)甲烷菌聚類(lèi)(熱圖)分析
2.2.3 產(chǎn)甲烷菌的菌屬演替過(guò)程
優(yōu)勢菌群是一個(gè)群落中的主要構成部分，基于1.2.2節的結果對管網(wǎng)中的優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行進(jìn)一步的分析. 圖 5反映了管網(wǎng)中優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌相對豐度的沿程變化，結果表明，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，這3種產(chǎn)甲烷菌相對豐度變化規律較為明顯. 在管網(wǎng)30 m處，3種菌屬都不存在，在管網(wǎng)100~800 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在3種優(yōu)勢菌屬中最高，且隨著(zhù)管網(wǎng)距離的增加相對豐度也不斷增加，與之相反，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在管網(wǎng)100~800 m的范圍內相對豐度的沿程變化趨勢與甲烷八疊球菌屬?lài)栏裣喾�，它們的相對豐度在管網(wǎng)中沿程降低，其中甲烷桿菌科中的菌屬在600~800 m之間失去優(yōu)勢地位，相對豐度均在0.7%以下; 在管網(wǎng)1 000~1 200 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度降低并保持穩定，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬相對豐度升高并保持穩定，其中廣古菌門(mén)中的菌屬)超過(guò)甲烷八疊球菌屬成為3種菌屬中相對豐度最高的菌屬. 從圖 5中可以看出，600 m和800 m、 1 000 m和1 200 m的優(yōu)勢菌屬的相對豐度變化不大，這與圖 4中的群落結構分析可以很好地對應起來(lái)，也說(shuō)明了群落中的優(yōu)勢菌屬的構成基本反映了群落結構的構成情況. 同時(shí)，在800~1 000 m的過(guò)程中，3種產(chǎn)甲烷菌的相對豐度、 優(yōu)勢地位和變化趨勢都發(fā)生了改變，說(shuō)明在該管網(wǎng)范圍內，產(chǎn)甲烷菌群中菌屬發(fā)生了演替過(guò)程，即在該處廣古菌門(mén)中的菌屬取代了甲烷八疊球菌屬成為第一優(yōu)勢菌屬.
圖 5 優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌相對豐度在管網(wǎng)中的沿程變化
2.3 產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)的變化規律
圖 6反映了產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)的變化情況. 管道中存在的產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)有甲酸、 甲醇、 甲胺、 乙酸(“三甲一乙”)和H2，其中乙酸的含量最高，而甲胺的含量極低. 由于H2是氣相產(chǎn)物且在管網(wǎng)中的含量很低，本文對H2不做過(guò)多論述. “三甲一乙”這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中的變化規律基本一致，均呈現出先增加后降低的變化趨勢.
圖 6 管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌可以用基質(zhì)的沿程變化
乙酸在整個(gè)管網(wǎng)中含量最高，在管網(wǎng)0~600 m沿程增加并在600 m處達到最大值8.67mg ·L-1，并在600~800 m處保持穩定，而后開(kāi)始沿程逐漸下降; 甲酸在管網(wǎng)0~400 m沿程增加并在400 m處達到最大值3.64mg ·L-1，而后開(kāi)始沿程降低; 甲醇在30 m處達到最大值2.17mg ·L-1后開(kāi)始沿程降低; 而甲胺在整個(gè)管網(wǎng)中的含量之中保持在很低的水平且濃度不超過(guò)0.015mg ·L-1，在800 m處含量最高0.011mg ·L-1. 這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中均存在含量降低的現象，說(shuō)明這4種基質(zhì)在管網(wǎng)中都被產(chǎn)甲烷菌利用生成CH4. 在管網(wǎng)中，乙酸是含量最高的產(chǎn)甲烷可利用基質(zhì)，即產(chǎn)甲烷菌可以利用的乙酸多，且根據厭氧三階段理論，在發(fā)酵產(chǎn)甲烷過(guò)程中72%的CH4主要來(lái)自于乙酸[29]，說(shuō)明在管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌主要利用乙酸. 管網(wǎng)中0~800 m處甲烷八疊球菌屬相對豐度最高，主要利用乙酸生成CH4[30, 31]，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在該范圍內沿程增加，這很好地解釋了在0~800 m乙酸含量的變化情況，且600~800 m乙酸含量保持穩定，而甲烷八疊球菌屬的相對豐度也保持穩定; 管網(wǎng)800 m處以后，乙酸含量下降，且微生物代謝過(guò)程中使得某些中間產(chǎn)物富集，這對甲烷八疊球菌屬而言，環(huán)境開(kāi)始變得惡劣，這就使得其在該環(huán)境下處于不利的地位，競爭能力下降，從而相對豐度下降，廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在該環(huán)境下競爭優(yōu)勢增強，相對豐度增加. 具體參見(jiàn)污水寶商城資料或http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
3 結論
(1)城市污水管網(wǎng)中生成CH4的量較低，管網(wǎng)中甲烷化程度較低. 在管網(wǎng)初始端沒(méi)有CH4的產(chǎn)生，而后隨著(zhù)管網(wǎng)距離的增加，CH4在管網(wǎng)中呈現出了逐漸增加的變化趨勢.
(2)城市污水管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌主要包含，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門(mén)中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬這3種. 產(chǎn)甲烷菌的群落結構在800~1 000 m發(fā)生了明顯的改變，在管網(wǎng)該范圍內發(fā)生了廣古菌門(mén)中的菌屬取代甲烷八疊球菌屬成為第一優(yōu)勢菌屬的演替過(guò)程.
(3)城市污水管網(wǎng)中產(chǎn)甲烷菌可利用基質(zhì)“三甲一乙”中乙酸含量最高，甲胺含量始終維持在極低的水平. 這些物質(zhì)在管網(wǎng)中均呈現出了先增加后降低的變化趨勢，其中乙酸在600~800 m含量維持穩定. 由于不同產(chǎn)甲烷菌屬適應的物質(zhì)條件和環(huán)境條件不同，因此這些物質(zhì)條件和環(huán)境條件的改變，使得產(chǎn)甲烷菌在管網(wǎng)中的分布發(fā)生了改變.（來(lái)源及作者：西安建筑科技大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院 孫光溪 金鵬康 宋吉娜 王先寶 楊柯瑤）
