高通量測序技術(shù)應用于污水處理廠(chǎng)細菌氣溶膠群落結構分析

　　1 引言(Introduction)

　　微生物氣溶膠在自然環(huán)境中普遍存在(Després et al., 2012;房文艷等, 2015;方治國等, 2005).通常, 微生物氣溶膠含有細菌和真菌等微生物粒子, 按其種類(lèi)被分為細菌氣溶膠和真菌氣溶膠.細菌氣溶膠粒徑范圍為0.5~100 μm, 芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、葡萄球菌(Staphylococcus)等為常見(jiàn)的細菌種類(lèi)(于璽華, 2002).有研究證實(shí), 污水處理過(guò)程有微生物氣溶膠的產(chǎn)生和逸散(劉建偉等, 2013;Han et al., 2013;Brandi et al., 2000;Li et al., 2013).由于污水及其處理設施中的微生物以細菌為主, 因此, 污水處理廠(chǎng)微生物氣溶膠的研究對細菌群落結構更為關(guān)注, 特別是污水中存在病原菌和潛在致病細菌.因此, 要解析污水處理廠(chǎng)微生物氣溶膠中細菌群落多樣性, 選擇適宜的采樣和分析方法是關(guān)鍵.

　　根據采樣器的原理, 微生物氣溶膠采樣方法分為自然沉降法、射流撞擊式采樣法、離心式采樣法、過(guò)濾式采樣法和靜電沉降式采樣法(于璽華, 2002;李濤, 2003).其中, 固體多級撞擊式的Andersen采樣器具有操作簡(jiǎn)便、采樣效率高、微生物存活率高等優(yōu)點(diǎn), 通常作為可培養微生物氣溶膠采集的標準方法被廣泛應用(Xu et al., 2013).此外, 過(guò)濾式采樣法具有抽氣設備流量大、收集效率高等優(yōu)點(diǎn), 其中, 大流量的總懸浮顆粒物采樣器常應用于基于非培養法的微生物氣溶膠分子生物學(xué)研究(Cao et al., 2014).在分析方法方面, 傳統的培養法在研究微生物氣溶膠的微生物多樣性方面存在局限性, 只能檢測可培養微生物, 其數量不到微生物總數的10%(Dong et al., 2016;Urbano et al., 2011).近年來(lái), 隨著(zhù)現代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展, 空氣微生物群落的解析方法也從培養法向非培養法發(fā)展(方治國等, 2016).16S rDNA克隆文庫技術(shù)(Urbano et al., 2011;Han et al., 2012)、聚合酶鏈式反應-變性凝膠梯度電泳(Polymerase chain reaction- denatured gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)(Xu et al., 2013)、基因芯片技術(shù)(Peccia et al., 2006;方治國等, 2016)、末端限制性酶切片段長(cháng)度多態(tài)性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)(方治國等, 2016)、熒光原位雜交技術(shù)(Fluorescence in situ hybridization, FISH)(Lange et al., 1997)、定量PCR技術(shù)(Wery et al., 2008;Yamamoto et al., 2014)和空氣微生物宏基因組學(xué)(Cao et al., 2014;Yamamoto et al., 2014;Dannemiller et al., 2014)等技術(shù)在環(huán)境細菌氣溶膠和真菌氣溶膠的群落組成鑒定、豐度的確定、對特異性的致病細菌或病毒的定量檢測中已有應用.此外, 指紋圖譜技術(shù)、核酸雜交技術(shù)及高通量測序技術(shù)可以直接在分子水平上全面分析復雜環(huán)境微生物群落結構及多樣性(Cao et al., 2014;Kumaraswamy et al., 2014).但如何解析污水處理廠(chǎng)細菌氣溶膠目前尚沒(méi)有標準方法.

　　本研究以某城市污水處理廠(chǎng)為研究對象, 以收集氣溶膠中全部細菌效率最高的總懸浮顆粒物采樣器進(jìn)行樣品收集, 并利用高通量測序技術(shù)對樣品中全部細菌的多樣性與群落結構進(jìn)行分析.作為對照, 同步采用收集氣溶膠中可培養細菌效率最高、應用最廣泛的Andersen六級采樣器采樣, 用克隆文庫技術(shù)進(jìn)行分析, 以對比高通量測序與傳統的培養法對同一采樣點(diǎn)細菌氣溶膠解析的異同, 為確定適宜污水處理廠(chǎng)細菌氣溶膠的分析方法提供科學(xué)依據.

　　2 材料與方法(Materials and methods)2.1 采樣點(diǎn)

　　細菌氣溶膠樣品采自某城市污水處理廠(chǎng), 該污水處理廠(chǎng)采用SBR工藝處理生活污水, 規模為5.0×104 m3·d-1.細菌氣溶膠采樣點(diǎn)沿污水處理工藝布置, 包括細格柵、粗格柵、沉砂池、SBR池和污泥脫水間.另外, 選取污水處理廠(chǎng)外的上風(fēng)向200 m和下風(fēng)向200 m處作為對照點(diǎn).采樣高度設置距地面1.5 m處(人呼吸高度).

　　2.2 采樣方法

　　總懸浮顆粒物采樣器：采用智能中流量便攜式總懸浮顆粒物采樣器(TH-150C, 武漢天虹儀表有限責任公司), 采樣膜為直徑90 mm的石英濾膜(PALL, NY, U.S.), 其對顆粒物的截留率為99.9%, 采樣流量為100 L·min-1, 采樣時(shí)間不低于4 h.不同采樣點(diǎn)的細菌氣溶膠樣品同步采集.采樣完畢, 用無(wú)菌鑷子取出采樣膜, 保存在無(wú)菌錫箔紙內, 盡快轉運到實(shí)驗室立即處理, 或者凍存于-80 ℃冰箱內.

　　Andersen采樣器：采用Andersen六級固體撞擊式采樣器(228-9530 K, SKC Gulf Coast Inc., USA), 由六級帶有微小噴孔的鋁合金圓盤(pán)撞擊器組成, 每級撞擊器有400個(gè)孔, 孔的直徑逐漸縮小, 模擬人體呼吸道的解剖結構和空氣動(dòng)力學(xué)特征, 采用慣性撞擊原理將空氣中懸浮的微生物粒子按照粒徑大小分等級地收集到采樣載體表面, 圓盤(pán)下方放盛有采樣介質(zhì)的培養皿, 本研究選取直徑為90 mm的營(yíng)養瓊脂平板(02-275, 北京奧博興生物技術(shù)有限責任公司)作為細菌氣溶膠分級截留介質(zhì), 設置抽氣速率為28.3 L·min-1, 樣品采集時(shí)間為3 min, 采集過(guò)程中設置3個(gè)平行.

　　2.3 分析方法2.3.1 DNA提取

　　總懸浮顆粒物中全細菌DNA提�。涸跓o(wú)菌條件下, 將總懸浮顆粒物采樣器收集在石英濾膜上的顆粒物樣品剪碎, 用40 mL無(wú)菌1×PBS緩沖液洗脫顆粒物, 置于4 ℃低溫低速離心機中, 200 g離心2 h.通過(guò)真空過(guò)濾裝置, 將上述離心后的緩沖液濃縮顆粒物至聚醚砜濾膜(PES)上, 剪碎此濾膜立即加入到MO-BIO PowerSoil DNA試劑盒(Carlsbad, CA, U.S.)中的PowerBead Tube中, 按參考文獻報道的優(yōu)化提取方法提取DNA(Jiang et al., 2015).

　　可培養細菌DNA提�。和ㄟ^(guò)Andersen采樣器收集細菌培養基上的顆粒物, 30 ℃恒溫培養48 h后, 使用1×PBS緩沖液收集所有細菌培養物, 采用核酸自動(dòng)提取儀(TanBead, 臺灣)對細菌總DNA進(jìn)行提取.

　　2.3.2 總懸浮顆粒物樣品的高通量測序與數據統計分析

　　總懸浮顆粒物中全部細菌的DNA測序所用擴增引物為V3+V4區338F/806R(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′/5′GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3);PCR擴增程序如下：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 27個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min;最后保持在10 ℃直到取出樣品.擴增產(chǎn)物采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 使用AxyPrep DNA凝膠抽提試劑盒(AXYGEN)對PCR產(chǎn)物切膠純化回收.

　　DNA序列通過(guò)Illumina Miseq平臺進(jìn)行測序, 按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元OTU(operational taxonomic units)聚類(lèi), 在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體, 得到OTU的代表序列.為了得到每個(gè)OTU對應的物種分類(lèi)信息, 采用Ribosomal Database Project(RDP) Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析, 并分別在門(mén)(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus)不同分類(lèi)水平下統計各樣本的群落組成.

　　2.3.3 可培養細菌克隆文庫的構建與多樣性分析

　　可培養細菌DNA產(chǎn)物經(jīng)過(guò)PCR擴增后構建克隆文庫, 所用引物及擴增程序、覆蓋度和多樣性的計算參考本課題組前期報道(Han et al., 2013), 其中, 覆蓋度C的計算方法如式(1)所示, C值≥75%方可認為挑取的克隆數足以反映真實(shí)的群落結構, C值越高, 表明挑取的克隆對真實(shí)群落的覆蓋程度越高.

　　(1)

　　式中, N為16S rDNA克隆文庫的庫容, 即挑取的陽(yáng)性克隆總數目;n1為16S rDNA克隆文庫中僅出現一次的克隆.

　　多樣性以Shannon-Wiener指數進(jìn)行評估, 計算方法如式(2)所示：

　　(2)

　　式中, Pi為第i個(gè)OTU在克隆文庫庫容中所占的比例, 本研究中在相似度≥97%分類(lèi)水平下劃分OTU, OTU越多表明鑒定的細菌種類(lèi)越多;S為克隆文庫中OTU的總數目.

　　3 結果與分析(Results and analysis)3.1 細菌氣溶膠豐富度和多樣性分析

　　分別對污水廠(chǎng)不同采樣點(diǎn)樣品的克隆文庫和高通量測序的結果進(jìn)行統計, 結果見(jiàn)圖 1.通過(guò)克隆文庫挑取的陽(yáng)性克隆數范圍為43~107個(gè), 劃分的OTUs個(gè)數為11~37個(gè);高通量測序技術(shù)獲得的序列數范圍為23656~42383個(gè), 劃分的OTUs個(gè)數為1212~1638個(gè).基于克隆文庫技術(shù)用某一陽(yáng)性克隆的序列來(lái)代表某一物種、高通量測序技術(shù)用某一序列代表某一物種的原理, 顯而易見(jiàn), 各采樣點(diǎn)用“總懸浮顆粒物采樣器+高通量測序技術(shù)”檢測出的物種數量均遠多于用“Andersen六級采樣器+克隆文庫技術(shù)”檢測出的物種數量, 表明高通量測序技術(shù)對于細菌氣溶膠群落結構豐富度的表征具有優(yōu)勢.

　　圖 1

　　圖 1 16S rDNA克隆文庫(a)和高通量測序技術(shù)(b)分析細菌氣溶膠獲取的測序信息

　　進(jìn)一步對上述測序結果做細菌群落組成覆蓋度的評價(jià), 結果如圖 2所示.克隆文庫技術(shù)對污水處理廠(chǎng)不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細菌的覆蓋度范圍為77.50%~90.40%, 不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細菌群落結構的覆蓋度差別較大;而高通量測序對所有細菌氣溶膠的覆蓋度均大于99%.上述結果表明, 盡管克隆文庫技術(shù)和高通量測序技術(shù)在呈現氣溶膠中細菌群落結構覆蓋度方面均達到了實(shí)驗理論的標準要求, 但高通量測序技術(shù)在呈現群落結構覆蓋度的穩定性和全面性方面顯著(zhù)優(yōu)于克隆文庫技術(shù).

　　圖 2

　　圖 2通過(guò)16S rDNA克隆文庫和高通量測序技術(shù)分析細菌氣溶膠群落結構的覆蓋度

　　對各采樣點(diǎn)氣溶膠樣品中的細菌多樣性(屬分類(lèi)水平)進(jìn)行分析, 結果見(jiàn)圖 3.依據式(2)計算的氣溶膠中的細菌Shannon-Wiener指數表明, 克隆文庫分析可培養細菌的多樣性指數為0.58(粗格柵)~2.37(污泥脫水間), 而通過(guò)高通量測序對全部細菌多樣性指數的分析結果為5.06(細格柵)~5.99(污泥脫水間).高通量測序技術(shù)檢測到的各采樣點(diǎn)氣溶膠中的細菌多樣性均遠高于克隆文庫檢測到的結果.具體聯(lián)系污水寶或參見(jiàn)http://www.sharpedgetext.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。

　　圖 3

　　圖 3通過(guò)16S rDNA克隆文庫和高通量測序技術(shù)分析細菌氣溶膠的Shannon-Wiener指數

　　3.2 細菌氣溶膠群落結構的解析

　　在門(mén)、綱、目、科和屬5種分類(lèi)水平下, 分別對污水處理廠(chǎng)各采樣點(diǎn)的細菌氣溶膠克隆文庫和高通量測序的結果進(jìn)行統計(表 1), 結果表明, 無(wú)論在何種分類(lèi)水平下, 高通量測序對于氣溶膠中的細菌群落組成的解析更全面.

　　表 1 克隆文庫和高通量測序對細菌氣溶膠在不同分類(lèi)水平的對比

 　　圖 4展示的是在門(mén)分類(lèi)水平下, “總懸浮顆粒物采樣器+高通量測序技術(shù)”和“Andersen六級采樣器+克隆文庫技術(shù)”對細菌氣溶膠群落組成的解析結果.在所有采樣點(diǎn)的細菌氣溶膠中, 克隆文庫僅檢測到厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)3種細菌門(mén)類(lèi), 其中前兩者為主要的細菌門(mén)類(lèi)(圖 4a), 同時(shí), 這兩種菌門(mén)在不同采樣點(diǎn)的分布差別較大, 例如, 厚壁菌門(mén)在粗格柵(90.0%)、細格柵(92.2%)和沉砂池(78.9%)的占比較高, 而變形菌門(mén)在曝氣池水面(62.1%)和污泥脫水間(74.4%)為優(yōu)勢菌門(mén).

　　圖 4

　　圖 4通過(guò)16S rDNA克隆文庫(a)和高通量測序技術(shù)(b)分析細菌氣溶膠在門(mén)類(lèi)水平的群落結構

　　高通量測序獲得的細菌門(mén)類(lèi)共有34個(gè)(表 1), 其中, 豐度≥1%的有11個(gè), 其100%地覆蓋了克隆文庫測得的3種優(yōu)勢菌門(mén).除此之外, 還特異地鑒定到包括擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes, 3.06%~13.48%)等在內的其他優(yōu)勢菌門(mén), 總比例為72.1%~91.7%(圖 4b).

　　上述結果表明, 在門(mén)分類(lèi)水平下, 克隆文庫技術(shù)由于測序通量低和挑取陽(yáng)性克隆的隨機性等弊端(張玉等, 2018), 重復檢出厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)細菌, 高估了其在污水廠(chǎng)細菌氣溶膠中的占比, 而低估甚至忽略了包括擬桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)等在內的其他細菌門(mén)類(lèi)的分布比例(圖 4b).高通量測序可一次并行對幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測定, 克服了克隆文庫測序的上述弊端, 可以更全面、客觀(guān)地對微生物群落多樣性進(jìn)行評估.

　　在屬分類(lèi)水平下, 利用克隆文庫分析技術(shù)檢測氣溶膠中的細菌群落組成如圖 5所示, 在鑒定到的31個(gè)細菌菌屬中(豐度均大于1%), 各個(gè)采樣點(diǎn)的群落組成差別較大, 例如, 芽孢桿菌屬(Bacillus)為所有采樣點(diǎn)的優(yōu)勢菌屬, 其中, 在粗格柵和細格柵的細菌氣溶膠群落組成中占絕對優(yōu)勢, 分別占87.0%和74.8%, 而在曝氣池水面和污泥脫水間的比例分別為6.90%和15.0%;氣單胞菌屬(Aeromonas)為曝氣池水面處的優(yōu)勢菌屬(55.2%).導致不同采樣點(diǎn)氣溶膠中細菌群落結構差異的原因一方面是由于上述克隆文庫的技術(shù)弊端;另一方面與污水廠(chǎng)不同處理工段的構筑物特點(diǎn)、污水處理設施等有關(guān), 例如, 本研究選取的這座污水廠(chǎng)的粗格柵和細格柵為室內操作間, 其中, 粗格柵為地下7 m左右的操作間, 粗格柵和細格柵均不加蓋, 湍急的進(jìn)水將污水中大量的微生物釋放到空氣中形成氣溶膠, 在具有穩定氣象條件的室內環(huán)境中不斷累積, 導致其群落組成與設置于室外曝氣池處的氣溶膠中的細菌群落組成明顯不同.

　　圖 5

　　圖 5通過(guò)16S rDNA克隆文庫技術(shù)分析細菌氣溶膠在屬分類(lèi)水平的群落結構

　　高通量測序技術(shù)共檢測到422個(gè)細菌菌屬(表 1), 其中豐度≥1%的共有79個(gè)(豐度小于1%的全部歸類(lèi)為Others)(圖 6).兩種測序技術(shù)共同鑒定到6個(gè)菌屬, 高通量測序技術(shù)特異地檢測到的細菌菌屬占83.3%~98.5%, 其對于群落多樣性的解析顯著(zhù)優(yōu)于克隆文庫技術(shù).

　　圖 6

　　圖 6高通量測序技術(shù)分析細菌氣溶膠在屬分類(lèi)水平的群落結構

　　值得一提的是, “總懸浮顆粒物采樣器+高通量測序技術(shù)”和“Andersen六級采樣器+克隆文庫技術(shù)”對同一采樣點(diǎn)細菌氣溶膠的全部細菌和可培養細菌的優(yōu)勢群落鑒定結果幾乎完全不同, 而高通量測序對全部細菌群落結構的解析更能證明污水廠(chǎng)不同采樣點(diǎn)細菌氣溶膠與其逸散源的關(guān)系, 例如, 在進(jìn)水段的粗格柵和細格柵處的優(yōu)勢菌屬為氣單胞菌屬(10.7%、12.5%)和消化鏈球菌屬(Peptostreptococcaceae_unclassified)(15.1%、11.1%), 前者普遍存在于淡水、淤泥和污水等環(huán)境中(Parker et al., 2011), 而后者常見(jiàn)于人和動(dòng)物的口腔、腸道和呼吸道, 在人類(lèi)女性泌尿生殖道也是正常的生理菌群, 污水廠(chǎng)的進(jìn)水作為收納這類(lèi)微生物的水體(Lu et al., 2015;Jiang et al., 2015), 進(jìn)水過(guò)程中的跌水等環(huán)節會(huì )將其釋放到周?chē)�的環(huán)境中(Brandi et al., 2000;Li et al., 2013);而污泥脫水間氣溶膠中7.1%的細菌隸屬于細菌菌膠團(Zoogloea), Zoogloea為活性污泥的主體, 而本研究中污泥脫水間內的污泥脫水機為離心式且為不加蓋的設備, 在脫水過(guò)程中會(huì )將活性污泥中的細菌直接釋放到周?chē)�空氣�?

　　上述結果表明, 細菌氣溶膠直接提取DNA并通過(guò)高通量測序對細菌氣溶膠優(yōu)勢菌的解析, 更能說(shuō)明細菌氣溶膠與其釋放源的關(guān)聯(lián)性, 可更全面、真實(shí)地反映細菌氣溶膠的群落分布狀態(tài), 近幾年高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展, 為空氣微生物的宏基因組解析提供了操作簡(jiǎn)便、通量大、信息全面、經(jīng)濟適用的技術(shù)支持(Behzad et al., 2015), 但該分析方法由于讀長(cháng)較短, 對于準確鑒定細菌的種類(lèi)存在一定缺陷.而通過(guò)傳統的可培養法結合克隆文庫收集并解析細菌氣溶膠, 實(shí)際是選擇性地收集易于培養細菌的過(guò)程, 因而導致其分析結果具有較強的隨機性和較大偏差, 此外, 該法操作繁復, 大批量、復雜空氣微生物的解析需大量的人力和高昂的費用, 獲取的序列通量有限, 盡管如此, 16S rDNA克隆文庫作為一項成熟的測序技術(shù), 可操作性強, 獲得的測序片段較長(cháng)(大約為1500 bp), 可以準確地確定微生物的分類(lèi), 對微生物多樣性較低樣本的準確鑒定依然適用.

　　4 結論(Conclusions)

　　通過(guò)總懸浮顆粒物采樣器收集污水處理全過(guò)程中的細菌氣溶膠, 并通過(guò)高通量測序技術(shù)對其進(jìn)行序列測定, 結果表明, 相對于對照組采用Andersen采樣器的傳統可培養方法和克隆文庫分析方法, 前者特異地檢測到細菌氣溶膠中83.3%~98.5%的細菌菌屬, 氣溶膠中的多個(gè)細菌優(yōu)勢菌屬在污水、污泥中廣泛存在, 因此, 采用“總懸浮顆粒物采樣器+高通量測序技術(shù)”在解析污水處理廠(chǎng)氣溶膠中細菌多樣性、群落結構覆蓋度、穩定性和全面性方面具有明顯的優(yōu)勢, 能客觀(guān)說(shuō)明細菌氣溶膠與其釋放源的關(guān)聯(lián)性, 全面和真實(shí)地反映細菌氣溶膠的群落分布狀態(tài).但該分析方法由于讀長(cháng)較短, 對于準確鑒定細菌的種類(lèi)尚存在一定缺陷.(來(lái)源：環(huán)境科學(xué)學(xué)報 作者：許光素)